Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden
9. August 2024
In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.
In dieser Arbeit stellen wir Methoden zur Sphäroidbildung vor und vergleichen sie, die zur Analyse des Zellstoffwechsels und der Sauerstoffverteilung mittels Lebendzellmikroskopie verwendet werden können. In den letzten Jahren wurde die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie ausgiebig eingesetzt, um metabolische Biomarker wie NADPH und FAD in lebenden Zellen zu untersuchen, und es wurden mehrere fluoreszierende Nanopartikel entwickelt, um solche Messungen mit der Bildgebung der Zell- und Gewebeoxygenierung zu multiplexen. Multizelluläre Sphäroide, Organoide und Organ-on-a-Chip können eine komplexe, in-vivo-ähnliche Mikroumgebung replizieren, wodurch der Bedarf an Tierversuchen minimiert wird.
Für die Herstellung von Sphäroiden zeigen wir verschiedene Bildungsmethoden, die von niedrigem bis hohem Durchsatz reichen können. Sie unterstreichen auch ihre optische Zugänglichkeit, die Kompatibilität mit einem Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskop und die Möglichkeit, extrazelluläre Matrixkomponenten einzubeziehen. Auch wenn 3D-In-vitro-Modelle im Vergleich zu 2D-Kulturen einen besseren Kontext bieten, bleiben ihre hohe Variabilität, geringe Reproduzierbarkeit und unvollständige experimentelle Berichterstattung ein Problem.
Parameter wie die Sphäroidgröße, die Nährstoffzusammensetzung, die extrazelluläre Viskosität und sogar Methoden zur Sphäroidbildung können zu einer erhöhten zellulären Heterogenität führen. Mit diesem Protokoll wollen wir die Methoden zur Herstellung von Sphäroiden harmonisieren und standardisieren und dabei Schlüsselaspekte hervorheben, die für die lebenskontinuierliche und multiparametrische Analyse von Sphäroiden mittels FLIM-Mikroskopie wichtig sind.
Übersicht
In diesem Artikel werden verschiedene Methoden zur Bildung multizellulärer Sphäroide vorgestellt, um den Zellstoffwechsel und die Sauerstoffverteilung mittels Live-Cell-Mikroskopie zu analysieren. Die Studie betont den Einsatz der Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (FLIM) zur Untersuchung metabolischer Biomarker in lebenden Zellen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Vitalzellbildgebung
Hintergrund
- Multizelluläre Sphäroide und Organoiden replizieren mikroumgebungen, die in vivo ähneln.
- Die Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie wird zur Untersuchung von metabolischen Biomarkern verwendet.
- Hohe Variabilität und geringe Reproduzierbarkeit sind Herausforderungen bei 3D-In-vitro-Modellen.
- Unterschiedliche Methoden zur Sphäroidbildung können für verschiedene Anwendungen eingesetzt werden.
Zweck der Studie
- Vergleich von Methoden zur Sphäroidbildung für die Live-Cell-Mikroskopie.
- Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods in 3D-Modellen.
- Verbesserung des Verständnisses der Sauerstoffverteilung in multizellulären Systemen.
Verwendete Methoden
- Abbildende Fluoreszenzlebensdauermessung (FLIM)
- Analyse der zellulären Autofluoreszenz
- Verwendung von Anfärbefarbstoffen und fluoreszierenden Nanopartikeln
- Verschiedene Techniken zur Sphäroidbildung
Hauptergebnisse
- Demonstrierte Methoden zur Analyse des Zellstoffwechsels in 3D-Sphäroiden.
- Zeigte die Verträglichkeit von Sphäroiden mit FLIM für Stoffwechselstudien auf.
- Unterstrich die Bedeutung von extrazellulären Matrixkomponenten bei der Sphäroidbildung.
- Behandelte Herausforderungen hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Variabilität von 3D-Kulturen.
Schlussfolgerungen
- Verschiedene Methoden zur Sphäroidbildung können die Analyse lebender Zellen verbessern.
- FLIM liefert wertvolle Einblicke in Stoffwechselprozesse in 3D-Modellen.
- Die weitere Entwicklung dieser Methoden kann die Abhängigkeit von Tierversuchsmodellen verringern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die standardisierte Herstellung und die multiparametrige FLIM-Analyse von multizellulären Sphäroiden beheben entscheidende Herausforderungen bei der Modellierung von Tumormikroumgebungen für die Wirkstoffforschung. Die Harmonisierung der Sphäroidbildung und der Workflows für die Live-Zell-Bildgebung erhöht das Vorhersagevertrauen bezüglich metabolischer und hypoxiebezogener Messgrößen und unterstützt fundierte Entscheidungen in der frühen Entwicklungsphase. Dieser Ansatz stärkt die translationale Kontinuität und verringert biologische Risiken in Forschungs- und Entwicklungsportfolios im Bereich Onkologie und Stammzellen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Stoffwechselwegen und Sauerstoffgradienten in physiologisch relevanten 3D-Modellen.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung durch Quantifizierung von NADPH- und FAD-Biomarkern in lebenden Sphäroiden.
- Erleichtert die biologische Ent风险bewertung durch multiplexe Messungen des Stoffwechsels und der Hypoxie.
- Verbessert die Vorhersagesicherheit bezüglich Targetbindung und Wegmodulation in komplexen Systemen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Erstellt reproduzierbare 3D-Sphäroidmodelle, die mit Weitfeld-, Konfokal- und Zwei-Photonen-FLIM-Plattformen kompatibel sind.
- Standardisiert Assaybedingungen, um die Variabilität zu verringern und die Zuverlässigkeit quantitativer Ergebnisse zu verbessern.
- Ermöglicht eine skalierbare, hochdurchsatzfähige Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf Zellstoffwechsel und Zellviabilität.
- Unterstützt eine robuste Bewertung der Integration von Bio- und Nanosensoren für multiplexe Ausleseverfahren.
Translationale und präklinische Forschung
- Stimmt in vitro Stoffwechsel- und Hypoxieprofile mit krankheitsrelevanten Tumormikroumgebungen ab.
- Gewährleistet Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem die Abhängigkeit von Tiermodellen minimiert wird.
- Ermöglicht risikoadjustierte Fortschrittsentscheidungen basierend auf quantitativen, multiparametrischen Daten.
- Ermöglicht die translationale Biomarkerentwicklung unter Verwendung von Live-Cell-FLIM-Daten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser harmonisierte Workflow integriert die frühe Entdeckung bis hin zur Leitstrukturidentifizierung und präklinischen Validierung und nutzt standardisierte Sphäroid-Produktion sowie FLIM-Analysen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen in 3D, lebendenähnlichen Kontexten.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative Stoffwechsel- und Hypoxie-Auswertungen für die Substanztriage.
- Analytik: Ermöglicht multiplexe Messungen der Fluoreszenzlebensdauer für robuste Bedingungsvergleiche.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Ergebnisse mit präklinischen Modellen, indem Merkmale der Tumormikroumgebung nachgebildet werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für vielfältige Onkologie- und Stammzell-F&E-Programme.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in 3D-Modellsystemen.
- Operationaler Wert: Verbessert die Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Workflows für die Live-Cell-Bildgebung.
- Strategischer Wert: Verbessert Go/No-Go-Entscheidungen und die Kapitalnutzungseffizienz, indem robuste, quantitative Daten bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Kandidaten mit nachgewiesener biologischer Relevanz.
Umsetzungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der 3D-Zellkultur, der Live-Cell-Mikroskopie und der FLIM-Analytik.
- Setzt Zugang zu FLIM-Geräten mit Weitfeld-, Konfokal- oder Zwei-Photonen-Technologie sowie kompatibler Analyse-Software voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Herstellung von Sphäroiden und den Bildaufnahmeprotokollen.
- Kann Anpassungen für verschiedene Zelltypen, extrazelluläre Matrizen oder die Integration von Sensoren erfordern.
- Die Variabilität in Größe und Zusammensetzung der Sphäroide kann die Reproduzierbarkeit und die Dateninterpretation beeinflussen.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:51
High‐Throughput Generation of Multicellular Spheroids from Human Cancer Cell Line for Live 3D Imaging
4:15
Assessing the Impact of Spheroid Formation Methods in 3D Cell Culture Systems Using Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)
