Aufbereitung von gefrorenen nicht-menschlichen Primateninseln für die kombinierte Einzelkern-RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung sowie Bulk-Metabolomik
8. November 2024
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenen nicht-menschlichen Primaten-Pankreasinseln für die Verwendung in der gleichzeitigen Einzelkern-RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung unter Beibehaltung der zytosolischen Massenfraktion für metabolomische Analysen aus denselben Proben.
Wir verwenden ein hochtranslationales, nicht-humanes Primatenmodell, um zu untersuchen, wie die Ernährung der Mutter und der Medikamentenkonsum während der Schwangerschaft die Embryonalentwicklung und die postnatale Funktion der Pankreasinseln bei den Nachkommen beeinflussen. Entwicklungsbedingt programmierte Veränderungen könnten die Anfälligkeit für Krankheiten im späteren Leben verändern. Eine Herausforderung bei der Arbeit mit schwer zu beschaffenden Proben, wie z. B. denen von nicht-menschlichen Primaten, besteht darin, mehrere Fragen derselben Person effizient auszuwerten.
Leider kann es schwierig sein, gleichzeitig Informationen aus dem Metabolom und dem Genom zu extrahieren, da die Assay-Reagenzien beim zeitkritischen Abbau der zu quantifizierenden Moleküle inkompatibel sind. Unser Protokoll ermöglicht die Extrapolation der Metabolitenhäufigkeit, der Chromatinzugänglichkeit und der differentiellen Genexpression aus demselben Ausgangsmaterial. Dieser mehrschichtige Ansatz gibt Aufschluss darüber, wie der Stoffwechsel das Genom in Pankreasinseln verändern kann.
Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Isolierung hochwertiger Zellkerne aus gefrorenen, nicht-menschlichen primaten Pankreasinseln für die gleichzeitige RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung. Es erhält außerdem die gesamte zytosolische Fraktion zur Durchführung metabolomischer Analysen und ermöglicht so ein umfassendes Verständnis metabolischer und genomischer Wechselwirkungen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Metabolomik
Hintergrund
- Nichtmenschliche Primatenmodelle sind entscheidend für die Untersuchung menschlicher Krankheitsmechanismen.
- Die mütterliche Ernährung und Medikation kann die Entwicklung der Inselzellen des Pankreas der Nachkommen beeinflussen.
- Die gleichzeitige Analyse von Metabolom und Genom ist aufgrund des Probenabbaus herausfordernd.
- Diese Studie adressiert die Notwendigkeit effizienter mehrschichtiger Analysen aus begrenzten Probenmengen.
Zweck der Studie
- Untersuchung des Einflusses mütterlicher Faktoren auf die embryonale Entwicklung der Pankreasinseln.
- Untersuchung, wie metabolische Veränderungen die genomische Expression beeinflussen können.
- Entwicklung eines Protokolls, das eine umfassende Analyse derselben Probe ermöglicht.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Kernen aus den Langerhans-Inseln des Pankreas.
- Gleichzeitige RNA-Sequenzierung und ATAC-Sequenzierung.
- Konservierung zytosolischer Fraktionen für metabolomische Untersuchungen.
- Mehrschichtige Analyse zur Beurteilung der Metabolitenkonzentration und Genexpression.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von hochwertigen nukleären und zytoplasmatischen Fraktionen.
- Erkenntnisse darüber, wie die mütterliche Ernährung die Funktion der Pankreasinseln beeinflusst.
- Nachweis der Durchführbarkeit simultaner genomischer und metabolomischer Analysen.
- Aufdeckung potenzieller Zusammenhänge zwischen Stoffwechsel und Genexpression in den Inseln.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll ermöglicht eine umfassende Analyse von Pankreasinseln.
- Die Ergebnisse könnten zukünftige Studien zur Krankheitsanfälligkeit beeinflussen.
- Unterstreicht die Bedeutung mütterlicher Einflüsse auf die Gesundheit der Nachkommen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Integration von Single-Nucleus-RNA-seq, ATAC-seq und Bulk-Metabolomik aus gefrorenen Inseln von nichtmenschlichen Primaten löst ein kritisches Engpassproblem bei der multi-omischen Entdeckung unter Verwendung seltener oder wertvoller Proben. Dieser Ansatz ermöglicht ein umfassendes molekulares Profiling aus begrenztem Material und unterstützt die Vorhersagegenauigkeit bei der frühen Zielvalidierung sowie die mechanistische Risikominderung. Das Protokoll maximiert den Datenertrag pro Probe und unterstützt risikoadjustierte Portfolioentscheidungen in der Forschung zu Stoffwechsel- und Entwicklungserkrankungen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der metabolischen und epigenetischen Mechanismen, die der zellulären Identität in krankheitsrelevanten Systemen zugrunde liegen.
- Unterstützt die funktionelle Target-Validierung, indem die Häufigkeit von Metaboliten mit Genexpression und Chromatinzugänglichkeit verknüpft wird.
- Erleichtert die mechanistische Entlastung von Risiken durch die Integration mehrschichtiger molekularer Daten aus derselben biologischen Quelle.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bereitet validierte nukleäre und zytoplasmatische Fraktionen für nachgeschaltete Hochdurchsatz-Sequenzierungs- und Metabolomik-Analysen vor.
- Verbessert die Reproduzierbarkeit und Standardisierung von Assays, indem Batch-Effekte in multikohortenbasierten Studien minimiert werden.
- Ermöglicht quantitative, multi-omische Ausgaben zur robusten Bewertung von Verbindungen oder Störungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Koppelt molekulare Messgrößen mit krankheitsrelevanten metabolischen und epigenetischen Biomarkern in translationalen Modellen.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung durch die Nutzung von nichtmenschlichen Primatensystemen.
- Liefert prädiktive Erkenntnisse über Mechanismen der Entwicklungsdeterminierung und der Anfälligkeit für Erkrankungen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Protokoll verbindet die frühe Entdeckung, die Zielvalidierung und die translationale Forschung, indem es die multi-omische Profilierung seltener Gewebeproben ermöglicht.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zu metabolisch-epigenetischen Wechselwirkungen bei der Inselentwicklung.
- Screening: Ermöglicht reproduzierbare Präparationen von Kernen und Metaboliten für skalierbare Omics-Analysen.
- Analytik: Liefert quantitative Daten zur Genexpression, Chromatinzugänglichkeit und Metabolitenhäufigkeit für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet molekulare Befunde mit krankheitsrelevanten Phänotypen in nichtmenschlichen Primatenmodellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen wiederverwendbaren Workflow zur Maximierung der Datengewinnung aus begrenzten oder archivierten Proben.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Mehrdeutigkeiten in der frühen Forschung.
- Operationaler Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung für Multi-Omics-Analysen und minimiert Batch-Effekte.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen und eine kapitaleffiziente Nutzung seltener Proben.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Programmen zu Stoffwechsel- und Entwicklungserkrankungen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung von Zellkernen, der Einzelzellkern-Sequenzierung und in Metabolomik-Workflows.
- Setzt Zugang zu Hochdurchsatz-Sequenzierungs- und Massenspektrometrie-Infrastruktur voraus.
- Erfordert eine strenge standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg, um Batch-Effekte zu kontrollieren.
- Kann auf andere Gewebetypen übertragen werden, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung des Protokolls für unterschiedliche Probenmatrizes.
- Die begrenzte Verfügbarkeit von Proben und ihre Empfindlichkeit gegenüber Degradation stellen praktische Einschränkungen hinsichtlich Durchsatz und zeitlichem Ablauf dar.
