Verwendung von R, Seurat und CellChat zur Analyse eines Einzelzell-Transkriptomik-Datensatzes der Wundheilung der Maushaut

In unserem Labor verwenden wir neue Werkzeuge wie Einzelzell- und räumliche Transkriptomik mit Ansätzen der Systembiologie und Bioinformatik, um die räumliche, zeitliche zelluläre Dynamik unterschiedlicher Heilungsergebnisse zu untersuchen. In den letzten Jahren haben wir eine rasche Einführung der Einzelzell-Transkriptomik bei der Untersuchung der Wundheilung beim Menschen und in Modellorganismen wie Mäusen gesehen. Die vollständige Analyse von Einzelzelldatensätzen ist für Laborwissenschaftler mit wenig bis gar keiner Erfahrung in der Bioinformatik unerschwinglich. Das bedeutet, dass Einzelzelldatensätze von Wissenschaftlern auf dem Gebiet der Wundheilung allzu oft zu wenig genutzt werden. Dies ist das erste umfassende Protokoll, das keine Vorkenntnisse in der Bioinformatik voraussetzt und den Benutzer vom Download des Datensatzes bis zur Ausgabe relevanter Analysen im Rahmen der Wundheilungsforschung begleitet. Unser Protokoll soll als Vorlage für Wundheilungsforscher dienen, um ihre eigenen Einzelzelldatensätze vollständiger zu analysieren und neue Erkenntnisse aus öffentlich zugänglichen Datensätzen gewinnen zu können.

[Shalyn] Navigieren Sie zunächst zu den Datensatzdateien aus dem Genexpressions-Omnibus-Repository mit der Zugangsnummer GSE204777. Klicken Sie auf den ersten Datensatz mit dem Titel GSM6190913. Scrollen Sie zum Ende der GSM6190913 Seite und laden Sie die drei aufgelisteten Dateien entweder über die FTP- oder HTML-Links herunter. Verschieben Sie die heruntergeladenen Dateien mithilfe des Datei-Explorers des Computers in ein Verzeichnis mit dem Namen b1, und stellen Sie sicher, dass es sich im Arbeitsverzeichnis befindet. Rufen Sie die Verzeichnispfadinformationen für die Einzelzellsequenzierungsdateien ab, die heruntergeladen wurden. Laden Sie nun die Einzelzell-Sequenzierungsdateien in die Arbeitsumgebung. Trennen Sie dann die Genexpressions- und Multiplexing-HTO-Daten vom Arbeitsdatensatz. Erstellen Sie ein Seurat-Objekt unter Verwendung der Genexpressionsdaten, während Sie Gene herausfiltern, die in weniger als fünf Zellen und Zellen mit weniger als 200 Genen nachgewiesen wurden. Erstellen Sie bei Datensätzen, bei denen HTO-Daten fehlen, das Seurat-Objekt mit denselben Filterparametern und wechseln Sie zum Genexpressionsassay. Berechnen Sie den Prozentsatz des mitochondrialen Gens in jeder Zelle und weisen Sie diesen Wert als Metadatenvariable zu. Visualisieren Sie die Verteilung der Genanzahl, der Gesamt-RNA und des mitochondrialen Genanteils über alle Zellen. Entfernen Sie Zellen mit einem mitochondrialen Gehalt von mehr als 25 % anhand eines Schwellenwerts und visualisieren Sie die aktualisierten Verteilungen nach dem Herausfiltern dieser Zellen von geringer Qualität. Erkennen Sie wahrscheinliche Dubletten mit der SC-Dublettenfinder-Methode. Führen Sie die SC-Doublet-Finder-Pipeline mit den Befehlen aus, und weisen Sie die resultierenden Doublet-Scores als neue Metadatenvariable zu. Visualisieren Sie nun die Verteilung der Doublet-Werte über alle Zellen. Entfernen Sie alle Zellen mit Doublet-Werten über 0,25 und speichern Sie das bereinigte Seurat-Objekt als RDS-Datei im Arbeitsverzeichnis. Führen Sie Datennormalisierung, Skalierung und Analyse der Hauptkomponenten durch. Visualisieren Sie den Varianzbeitrag über die ersten 50 Hauptkomponenten. Clustern Sie die Zellen mit den ersten 13 Hauptkomponenten und einer Clustering-Auflösung von 0,1. Führen Sie eine gleichmäßige Mannigfaltigkeitsannäherung und -projektion oder eine UMAP-Reduzierung in der Nachbaranalyse mit den ersten 13 Hauptkomponenten durch, und legen Sie die Startnummer auf 123 fest. Visualisieren Sie nun die Zellcluster-Bildung in einem UMAP-Diagramm, gefolgt von Wundzeit- und Raumanmerkungen in einem UMAP-Diagramm. Generieren Sie dann eine Tabelle, in der Zellcluster mit gewickelten Zeit- und Raumanmerkungen verknüpft werden. Bestimmen Sie die Identitäten der wichtigsten Zelltypen nach der Berechnung differentiell exprimierter Gene zwischen allen Clustern und weisen Sie die resultierenden DEG-Listen einer Variablen zu, bevor Sie sie als durch Trennzeichen getrennte Textdatei im Arbeitsverzeichnis speichern. Öffnen Sie nun die Datei mit den Dataset-Cluster-Markierungen in einer Tabellenkalkulationsanwendung. Verwenden Sie den Textimport-Assistenten, um das Komma als Trennzeichen festzulegen, und formatieren Sie Gennamenspalten als Text, um die automatische Konvertierung von Gennamen in Datumsangaben zu verhindern. Ordnen Sie in einer Tabelle die durchschnittliche logarithmus zwei FC-Spalten von der größten zur kleinsten, um die Zeilen zu sortieren, indem Sie die Werte für die zweifache Änderung des Protokolls verringern, gefolgt von der Clusterspalte von der kleinsten zur größten. Um die Zeilen nach Erhöhung der Seurat-Clusternummern zu sortieren, filtern Sie die durchschnittliche BZ-Spalte mit zwei Protokollen so, dass nur Werte größer oder gleich 2,5 enthalten sind, und filtern Sie dann die Spalte PCT 1 so, dass sie Werte größer oder gleich 0,4 enthält. Filtern Sie anschließend die Spalte PCT 2 so, dass sie Werte kleiner oder gleich 0,2 enthält. Filtern Sie abschließend die angepasste Spalte P-Wert so, dass sie Werte kleiner oder gleich 0,01 enthält. Öffnen Sie nun das webbasierte Anreicherungsanalysewerkzeug Enrichr. Kopieren Sie für jeden Cluster die Liste der differentiell exprimierten Gene in ein separates Enrichr-Fenster, und klicken Sie auf Analysieren. Klicken Sie dann auf die Registerkarte Zelltypen über der Analyseausgabe und konzentrieren Sie sich auf die fünf wichtigsten Anreicherungen in den drei kuratierten Zellmarkerdatenbanken. Weisen Sie den acht Clustern basierend auf den Top-Anreicherungen aus der Anreicherungsanalyse wahrscheinliche Identitäten zu. Kombinieren Sie die Cluster zwei und sechs in einer einzigen Annotation mit der Bezeichnung Fibroblasten und weisen Sie diese Annotationen als neue Metadatenvariable mit dem Namen cell types zu. Visualisieren Sie dann die annotierten Zelltypen in einem UMAP-Diagramm, und zeigen Sie die Lokalisierung der fett gedruckten Top-Cluster-Markergene in einer Reihe von UMAP-Diagrammen an. Visualisieren Sie die differentiell exprimierten Gene des Top-Cluster-Markers in einem Punktdiagramm, gruppiert nach den ursprünglichen Cluster-Nummern, und dann die Top-Marker-Gene erneut in einem Punktdiagramm, diesmal gruppiert nach annotierten Zelltypen. Um die Zeitreihenanalyse vorzubereiten, entfernen Sie räumliche Annotationen, und vereinfachen Sie das Dataset. Ordnen Sie die Metadaten für Zeit und Raum der Wunde einer neuen Variablen mit dem Namen DPW für Days Post Wounding zu. Visualisieren Sie die neuen DPW-Zeitverlaufsgruppierungen in einem UMAP-Diagramm, und generieren Sie Tabellen mit der Anzahl der Zellen jedes Typs innerhalb jeder DPW-Gruppe. Konvertieren Sie als Nächstes die Zellzahlen in Proportionen, um relative Änderungen in der Zelltypzusammensetzung während der Heilung zu bewerten und den Anteil jeder DPW-Kategorie innerhalb jedes Zelltyps zu visualisieren. Visualisieren Sie abschließend den Anteil der einzelnen Zelltypen innerhalb jeder DPW-Gruppe und speichern Sie das endgültige Seurat-Objekt mit allen Anmerkungen und Filtern als RDS-Datei im Arbeitsverzeichnis. Alle Zellen im Datensatz wurden im UMAP-Diagramm eindeutig in wichtige farbcodierte Zelltypen gruppiert, was die erfolgreiche Annotation auf der Grundlage angereicherter Zelltypsignaturen bestätigt. Eine hohe Expression von Top-Cluster-Marker-Genen war innerhalb ihrer jeweiligen Zelltyp-Cluster auf den UMAP-Diagrammen lokalisiert. Die Visualisierung von Dotplots bestätigte, dass die höchsten Expressionsniveaus von Cluster-Marker-Genen auf ihre annotierten Hauptzelltypen beschränkt waren. Das gestapelte Balkendiagramm zeigte, dass Neutrophile und Makrophagen am ersten Tag nach der Verwundung dominant waren, während Fibroblasten, Epithel- und Endothelzellen zu späteren Zeitpunkten häufiger vorkamen, was die bekannte zelluläre Kaskade der Wundheilung widerspiegelt.