Ein praktischer Workflow zur Analyse von räumlichen Transkriptomik-Daten: Von der Datenerfassung bis zu fortgeschrittenen Analysen

Hallo zusammen. In diesem Video führen wir eine praktische Analyse-Pipeline für räumliche Transkriptomik-Daten von der Datenerfassung und dem Laden bis zur grundlegenden Erkundung und schließlich zur fortgeschrittenen Analyse durch. Insgesamt besteht der Workflow aus drei Hauptschritten.

Zunächst müssen die Daten heruntergeladen, dann der Analysecode bezogen und schließlich die Analyse-Pipeline zur Erzeugung der Ergebnisse durchlaufen werden. Schritt eins: Datenerfassung und Vorbereitung der Verzeichnisstruktur. Beziehen Sie zunächst öffentliche räumliche transkriptomische Datensätze.

Laden Sie das Archiv mit den Rohdaten herunter und entpacken Sie es. Ordnen Sie die Dateien in einer standardisierten Verzeichnisstruktur an.

Erstellen Sie zunächst ein Hauptdatenverzeichnis und anschließend ein dediziertes Unterordner für jede Probe. Übertragen Sie die folgenden wesentlichen Dateien für jede Probe in das jeweilige Unterordner. Erstellen Sie danach einen räumlichen Unterordner innerhalb jedes Probenverzeichnisses.

Platzieren Sie die folgenden Dateien im räumlichen Unterordner. Platzieren Sie die gefilterte Feature-PC-Metrik-S1-Datei im Hauptunterverzeichnis der Probe. Entpacken Sie die Gzip-Dateien im räumlichen Ordner.

Stellen Sie sicher, dass die ursprünglichen Dateinamen exakt so bleiben, wie sie von der Funktion „load 10X spatial“ gefordert werden. Schritt zwei: Einrichtung der Softwareumgebung. Hier überspringen wir die Installation der R-Sprache und beginnen mit dem Abrufen des Analyseskripts aus dem GitHub-Repository.

Installieren Sie die erforderlichen R-Pakete von Graham in der Datei conductor, indem Sie das Setup-Skript R ausführen. Installieren Sie das Auto-Suit, indem Sie die Installationsbefehle aus dem offiziellen Dokumentblatt ausführen. Navigieren Sie zur offiziellen Installations-URL, um die Setup-Skripte abzurufen. Initialisieren Sie die erforderliche Python-Umgebung und die Systemabhängigkeiten gemäß den Anweisungen auf der Setup-Seite.

Beziehen Sie das benutzerdefinierte Tool, indem Sie zum GitHub-Repository navigieren und den Quellcode herunterladen. Navigieren Sie in das TOS-Verzeichnis und installieren Sie die Python-Abhängigkeiten. Schritt drei: Laden der räumlichen Daten und die Qualitätskontrolle.

Laden Sie die räumlichen Daten in ein Seurat-Objekt ein. Verwenden Sie „read 10X image“, um das hochauflösende Gewebild manuell zu laden. Geben Sie dabei das Bild und den Bildnamen an.

Verwenden Sie den Parameter „load 10X spatial“ mit dem Bild, das im vorherigen Schritt erstellt wurde, und erzeugen Sie das Seurat-Objekt. Berechnen Sie die Qualitätskontrollmetriken. Ermitteln Sie den Prozentsatz der mitochondrialen Reads mithilfe der Funktion „percentage feature set“ mit dem Muster mt.

Visualisieren und interpretieren Sie die Daten basierend auf QC-Metriken. Erstellen Sie Violin-Plots von nCount_Spatial, nFeature_Spatial und percent.mt mithilfe der Violin-Plot-Funktion.

Erstellen Sie räumliche Merkmalsdarstellungen dieser Metriken mithilfe räumlicher Merkmalsplots und identifizieren Sie Spots außerhalb des Gewebebereichs. Optional können Filter angewendet werden, um Spots von geringer Qualität zu entfernen.

Nachdem Sie das Skript ausgeführt haben, können Sie diese Ergebnisse erhalten, einschließlich QC-Metriken und der räumlichen Darstellung der Merkmale. Schritt vier: Daten-Vorverarbeitung, Integration und Clusterung. Normalisieren Sie zur Vorverarbeitung einzelner Proben.

Einzelne Anwendung der SC-Transform-Normalisierung auf jede Probe mit dem Assay Spatial. Integration mehrerer Proben. Vorbereitung der Liste der SCTransform-normalisierten Objekte für die Integration.

Stellen Sie sicher, dass jedes Objekt einen RNA-Assay aufweist, indem Sie den räumlichen Assay kopieren. Verwenden Sie die Funktion zur Auswahl integrierter Merkmale in der PREP SCT-Integration, um gemeinsame variable Merkmale zu identifizieren. Finden Sie die Integrationsanker mithilfe von „Find Integration Anchors“ mit der Normalisierungsmethode SCT.

Integrieren Sie die Daten mithilfe von IntegrateData. Führen Sie eine Dimensionsreduktion bei der Clusteranalyse auf dem integrierten Assay durch. Führen Sie PCA auf den integrierten Daten mit runPCA aus.

Bestimmen Sie die optimale Anzahl der Hauptkomponenten für die nachgeschaltete Analyse, indem Sie die kumulative erklärte Varianz berechnen. Identifizieren Sie den Ellenbogenpunkt programmgesteuert. Führen Sie UMap mit der ermittelten Anzahl an Hauptkomponenten durch.

Gruppieren Sie die Zellen mithilfe von FindNeighbors und FindClusters. Geben Sie die bestimmten PC in der Auflösung 0,5 an. Führen Sie eine differentielle Expressionsanalyse zwischen Zielgruppen mit der Funktion FindWorkers durch.

Identifizieren Sie räumlich variable Gene. Führen Sie für jede ursprüngliche Probe die Funktion „räumlich variable Merkmale finden“ mithilfe der Moran's-I-Methode auf dem SCT-Assay aus, um die räumliche Autokorrektur zu berechnen. Nach Ausführung dieses Skripts erhalten Sie die Ellbogenplot, die UMap-Plot, die Clusterplot, die Heatmap der Clustermarker, die Vulkanplot, die räumlich differenziell exprimierten Gene, die räumlich zuverlässigen Gene sowie die Marker der Darmwandlagen.

Und das Punktdiagramm der Kolonschichtmarker zusammen mit den Markern in der räumlichen Merkmalsdarstellung. Schritt fünf: Vorverarbeitung der Einzelzell-Referenzdaten. Lesen Sie die Einzelzell-RNA-seq-Zählmatrix mithilfe von read 10X ein und erstellen Sie ein Seurat-Objekt.

Standard-QC-Normalisierung und Entbündelung durchführen. Den Prozentsatz der mitochondrialen Reads in den gefilterten Zellen berechnen. Die Daten mithilfe der SC-Transformation normalisieren.

Legen Sie eine vara.to.-Regression für den Prozentsatz der mt-DNA fest. Führen Sie anschließend eine PCA und UMap-Darstellung durch und gruppieren Sie die Zellen mithilfe der dynamischen PC-Auswahlmethode, die in den vorherigen Schritten beschrieben wurde. Annotieren Sie danach die Zelltypen.

Berechnen Sie Modul-Scores für kanonische Marker-Gene von Zelltypen mithilfe von AddModuleScore. Annotieren Sie die Cluster basierend auf den Modul-Scores und dem bekannten biologischen Hintergrund. Alternativ importieren Sie vorab berechnete Annotationen aus den Metadaten.

Nachdem Sie dieses Skript gelernt haben, können Sie die QC-Metriken erhalten. Sie haben die UMap nach Cluster, die UMap nach Probe und die Zelltyp-Scores hochgeladen. Schritt sechs: Referenzgeleitete Dekonvolution mit SPOTlight.

Bereiten Sie zunächst die Daten für SPOTlight vor. Konvertieren Sie das annotierte Einzelzell-Seurat-Objekt und das räumliche Seurat-Objekt in ein Einzelzell-Experiment-Objekt. Normalisieren Sie die Einzelzelldaten mittels LogMoreCounts logarithmisch.

Führen Sie dann die SPOTlight-Dekonvolution durch. Identifizieren Sie zunächst hochvariabile Gene in den Einzelzell-Daten mithilfe von ModelGeneVar. Berechnen Sie Zelltyp-Marker mithilfe von Score-Markern und filtern Sie nach hochwertigen Markern.

Reduzieren Sie den Einzelzell-Referenzdatensatz für jeden Zelltyp auf eine überschaubare Anzahl, um die Rechenzeit zu verkürzen. Führen Sie die Dekonvolution mithilfe der SPOTlight-Funktion durch, wobei Sie den Einzelzell-Referenzdatensatz, die räumlichen Daten, die Markerliste und die hochvariablen Gene (HVGs) angeben, und visualisieren und exportieren Sie anschließend die Ergebnisse. Das Ergebnis der Dekonvolution können Sie wie folgt erhalten, dargestellt als Scatter-Pipe-Routing.

Schritt sieben, unbeaufsichtigte Dekonvolution mit Stdeconvolve. Bereiten Sie zunächst die räumlichen Daten vor. Extrahieren Sie die Zeilenzählmesswerte aus dem räumlichen Seurat-Objekt mithilfe von GetAssayData mit dem Slot counts.

Entfernen Sie niedrigqualitative Stellen und Gene mithilfe bereinigter Zählungen aus STdeconvolve. Identifizieren Sie die latenten Zelltypen für die Filter, bei denen vier Gene in einem minimalen Anteil der Stellen exprimiert werden, unter Verwendung einer restriktiven strengen LDA, indem Sie dieses Zuweisungsmodell über einen Bereich möglicher Themenanzahlen mittels fitLDA anpassen. Wählen Sie das optimale Modell basierend auf minimaler Komplexität unter Verwendung des optimalen Modells mit opt min aus.

Analysieren und visualisieren Sie die Ergebnisse. Extrahieren Sie den Serotyp-Anteil, Theta, und die Genprofile Beta für das optimale Modell mithilfe von getBetaTheta. Um die biologische Interpretation der Korrosionsthemen einzubeziehen, importieren Sie die durch das Werkzeug „select spatial spot“ erstellten Anmerkungen zu interessierenden Regionen.

Verwenden Sie diese Anmerkungen als Parametergruppe in der Funktion „with all topics“. Weisen Sie die entfalteten Anteile der Zelltypen in Ihrem Projekt zurück auf die räumlichen Koordinaten zu und codieren Sie die Spotpositionen farblich entsprechend ihrer ROI. Nach Ausführung des Skripts erhalten Sie ein Ergebnis wie dieses, eine Skalierungspipettenbelastung, wie sie von SPOTlight erzeugt wird.

Schritt acht, räumliche Zell-Zell-Kommunikation mithilfe von Giotto. Zunächst das Seurat-Objekt in ein Giotto-Objekt umwandeln. Verwenden Sie die Funktion createGiottoObject und geben Sie dabei die Metriken mit geringer Anzahl an Reads sowie die räumlichen Koordinaten an.

Verarbeiten Sie das Giotto-Objekt vor und fügen Sie das Entmischungsergebnis hinzu. Normalisieren Sie die Daten mithilfe der normalisierten Giotto-Methode und fügen Sie sie als Serotyp-Anmerkungen hinzu. Wählen Sie die Zell-Metadaten mit addCellmetadata aus.

Erstellen Sie ein räumliches Netzwerk mithilfe von createSpatialNetwork. Laden Sie eine Ligand-Rezeptor-Datenbank in unsere Umgebung. Führen Sie explore CellCellcom aus, um signifikante Ligand-Rezeptor-Interaktionen zwischen Zelltypen, die sich räumlich nahe befinden, zu identifizieren.

Sie können das Punkt-Diagramm zur Zell-Zell-Kommunikation wie folgt erstellen. Schritt neun ist optional. Interaktive Spot-Auswahl mit SelectSpatialSpot.

Bereiten Sie die Daten für das interaktive Tool mithilfe des Skripts six vor. Extrahieren Sie die räumlichen Koordinaten aus dem Seurat-Objekt mithilfe von GetTissueCoordinates. Formatieren und exportieren Sie die Daten.

Exportieren Sie den formative data frame in eine CSV-Datei. Führen Sie anschließend die Region-of-Interest-Analyse durch. Starten Sie die benutzerdefinierte Anwendung.

Wählen Sie die räumlichen Spots-Dash-Anwendungen aus und laden Sie die CSV-Datei. Wählen Sie interaktiv die Spots basierend auf dem räumlichen Standort aus. Exportieren Sie anschließend die Liste der ausgewählten Spots und ihrer zugeordneten Gruppe, gekennzeichnet als neue CSV-Datei.

Wir überprüfen einfach, was wir erhalten, nachdem wir das Skript nacheinander ausgeführt haben. Alle Ergebnisse werden im Ergebnis-Ordner fünfmal gespeichert. Wie Sie sehen können, erhalten wir die QC-Metriken und führen die Aufteilung durch.

Sie können hier die räumliche Merkmalsdarstellung überprüfen. Außerdem wurde der Dekonvolutionsprozess sowohl auf überwachte als auch auf unüberwachte Weise durchgeführt. Die SPOTlight-Ergebnisse finden sich hier.

Wie Sie sehen können, enthalten alle Spots die Anteilsinformationen. Die unüberwachten Entmischungsergebnisse mittels STdeconvolve werden hier ebenfalls erstellt. Und dies ist das Seurat-Cluster-Ergebnis des Spots in den räumlichen Daten.

Sie können sie auch in der räumlichen Team-Plot-Darstellung visualisieren, wie hier gezeigt. Darüber hinaus können Sie mithilfe von Giotto auch das Spot-Spot-Kommunikationsergebnis erhalten. Dieser gesamte Workflow ist zu 100 % Open Source.

Spotting-Analyse von den Expressionsmetriken bis hin zu fortgeschrittenen räumlichen Modellen. Alle Schritte laufen auf einer Maschine mit 16 GB RAM. Die Codebasis ist modular, mit einem Skript für jede Aufgabe.

Beachten Sie, dass dieser Workflow die upstream-Verarbeitung ab dem FASTQ-Preis nicht abdeckt. Der Fokus liegt auf den 2D-räumlichen Daten und umfasst derzeit nur die Downloader von Visium. Das ist alles, vielen Dank fürs Zuschauen.