Lipid-Protein-Membranstruktur-Funktions-Charakterisierung mittels Tropfen-Interface-Doppelschichten

In dieser Arbeit untersuchen wir, wie physikalische und elektrische Eigenschaften von Lipidmembranen und deren Umwelt die Ionenleitung in Tropfenschnittstellen-Doppelschichtmodellen beeinflussen. Die traditionelle Patch-Clamp-Elektrophysiologie untersucht nicht die Membranbiophysik im größeren Maßstab, aber diese einzelne Plattform erfasst sowohl Einzelkanalaktivität als auch größere Membranflächen im Millimetermaßstab, um die Membranbiophysik umfassender zu studieren. Zu Beginn bereiten Sie die chlorierten, mit Agarose beschichteten Silberdrahtelektroden und Lipidvesikellösungen für elektrophysiologische Experimente vor.

Für die Bildung der Tröpfchenschnittstellen-Doppelschicht wird eine klare Petrischale am Boden auf die Stufe eines umgekehrten Mikroskops gesetzt. Füllen Sie die Schale mit Alkanöl wie 100 % Hexadecan bis zu einer Tiefe von etwa fünf Millimetern. Nachdem Sie die Elektroden an der Patch-Klemme und dem Halter der Masseelektrode befestigt haben, verwenden Sie die Mikromanipulatorsteuerung, um beide mit Agarose beschichteten Kugelenden in das Öl auf eine Tiefe von etwa 2,5 Millimetern unter die Öloberfläche zu senken, wodurch schnelle Bewegungen vermieden werden, um Kollisionen mit der Petrischale zu vermeiden.

Stellen Sie den Mikroskopfokus so ein, bis beide Kugelenden und ihre Agarosebeschichtungen scharf scharf scharf sind. Positionieren Sie die Elektroden nahe dem Rand des Sichtfeldes, sodass beide gleichzeitig beobachtet werden können. Mit einer kalibrierten Zwei-Mikroliter-Pipette aspirieren Sie die extrudierten DPhPC-Lipidvesikel, die mit Gramicidin A dotiert sind. Geben Sie langsam 250 Nanoliter der Suspension direkt auf jedes mit Agarose beschichtete Kugelende ab, wobei jede mit einer separaten Pipettenspitze eine separate Pipettenspitze berührt, ohne die Agaroseschale zu berühren.

Lassen Sie die Tröpfchen sich über die Agaroseoberfläche ausbreiten und durch die Schwerkraft und die geringere Oberflächenspannung sichtbar nach unten sinken, wodurch eine hängende Tröpfchenform entsteht. Beobachte das Durchhängen von der Seite durch die Petrischalenwand, wenn sie klar ist. Nach fünf Minuten stupst du sanft den Antivibrationstisch an, um den Tropfen zu beurteilen.

Bestätigen Sie, dass sich die durchhängenden Tröpfchen mit einer leichten Verzögerung im Verhältnis zur Elektrodenbewegung bewegen, was auf die Bildung vollständig beschichteter Lipidmonoschicht-Tröpfchen hinweist. Wenn dieses Verhalten nicht beobachtet wird, warten Sie weitere zwei bis drei Minuten und wiederholen Sie die Untersuchung. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop, der Antivibrationstisch, der Faradaysche Käfig, der Verstärker, der Digitalisier, der Funktionsgenerator und der Computer an eine gemeinsame Masse angeschlossen sind.

Richten Sie die Instrumentenanschlüsse gemäß der Setup-Anleitung des Herstellers an und konfigurieren Sie das grundlegende elektrische und optische Setup, wobei Sie den detaillierten Anweisungen für Tropfenschnittstellen-Doppelschicht-Experimente folgen. Konfigurieren Sie einen externen Funktionsgenerator oder den Ausgangskanal der Erfassungssoftware, um eine 10-Hertz-Dreiecks-Spannungswelle mit 10 Millivolt zu erzeugen. Bestätigen Sie Amplitude und Frequenz an einem angeschlossenen Oszilloskop und in der Erfassungssoftware.

Nachdem die Tröpfchen etwa 10 Minuten durchgesackt sind, verwenden Sie die Mikromanipulatoren, um die beiden Tropfen sanft in Kontakt zu bringen. Schalten Sie die 10-Hertz-, 10-Millivolt-Dreieckswellenform ein und überwachen Sie die kapazitive Stromantwort in der Aufnahmesoftware. Passen Sie die Kontaktfläche des Tröpfchens an, indem Sie die Elektroden leicht bewegen, bis die kapazitive Stromantwort von Spitze zu Spitze auf die Wellenform zwischen etwa 100 und 200 Picoampere liegt.

Oder die Kontaktfläche beträgt nicht mehr als etwa ein Viertel des Tröpfchendurchmessers. Warten Sie auf spontane Doppelschichtbildung, die elektrisch durch eine sich ausdehnende kapazitive Stromantwort von Spitze zu Spitze und optisch durch eine zunehmende innere Reflexion mit ovalem Erscheinungsbild im Kontaktbereich angezeigt wird. Bestätigen Sie, dass reine Lipiddoppelschichten rechteckige Stromplateaus als Reaktion auf den dreieckigen Spannungsreiz zeigen, während gramicidin-gedopte Doppelschichten geneigte Plateaus aufweisen, die die Ensemble-Ionenleitung widerspiegeln.

Sobald stabil-kapazitive oder leitfähige Antworten bestätigt sind, wird die Dreieckswellenform ausgeschaltet und die Tröpfchenschnittstellen-Doppelschicht mindestens 15 Minuten lang ausgeglich, bevor Stimulationsprotokolle angewendet werden. In der Videoaufnahme-Software stellen Sie die Bildrate auf mindestens 20 Bilder pro Sekunde ein. Wählen Sie die entsprechenden Kamera- und Zielobjektiveinstellungen aus.

Als Nächstes klicken Sie auf Erwerben und wählen Sie Neues Protokoll. Im Reiter Erfassungsmodus wählen Sie episodische Stimulation aus. Setze Runs pro Versuch und Sweeps pro Run auf eins.

Passen Sie die Sweep-Dauer auf vier Sekunden länger als die gesamte experimentelle Dauer an, sodass eine zweisekündige Ausgangslinie vor und nach dem Reiz möglich ist. Stellen Sie die Abtastrate auf fünf bis zehn Kilohertz ein. Im Reiter Eingänge weisen Sie den Aufnahmekanal dem aktuellen Eingang zu.

Und dann im Reiter Ausgänge den Stimulationskanal der Spannungsausgang zuweisen, die die Elektroden steuert. Öffnen Sie den Reiter Wellenform. In Spalte A setzen Sie den Typ auf Schritt, das erste Niveau und das Delta-Level auf null Millivolt und die erste Dauer auf 2.000 Millisekunden, um eine Vorstimulationsbasis zu definieren.

In Spalte B stellen Sie den Typ Pulse für die gepaarte Impulserleichterung ein. Geben Sie die Werte für die erste Dauer und die Amplitude der ersten Stufe an und stellen Sie die Zuggeschwindigkeit so ein, dass das Interpulsintervall dem Ziel-Duty Cycle entspricht. Stelle die Pulsbreite auf 100 Millisekunden ein.

In Spalte C stellen Sie für gepaarte Pulsunterdrückung den Typ auf Puls mit derselben Amplitude und Pulsdauer ein. Stellen Sie die Zuggeschwindigkeit ein, um den gewünschten niedrigeren Tastzyklus zu erreichen, und stellen Sie die Impulsbreite ein. Anschließend konfigurieren Sie in Spalte D die Poststimulationsparameter identisch mit dem Vorstimulations-Baseline.

Überprüfen Sie das Protokoll und speichern Sie es mit einem beschreibenden Namen. Starten Sie die Videoaufnahme und starten Sie sofort mit der elektrischen Erfassung und Stimulation, indem Sie in jeder Software auf den Aufnahme-Button klicken. Während der ersten 60 Sekunden der Stimulation solltest du beobachten, dass der Strom zunimmt und ein Plateau erreichen kann.

In den letzten 60 Sekunden ist zu beobachten, dass der Strom abnimmt. Am Ende des Protokolls wird die elektrische Erfassung und Videoaufnahme gleichzeitig eingestellt. Führen Sie schließlich Nachbearbeitung durch, um die Membranfläche zu extrahieren und normalisierten Strom, Flächen und Fluss aus Bildgebungs- und elektrischen Daten zu berechnen.

Sequentielle Bilder zeigten spontanes Doppelschicht-Zippen und Flächenausdehnung, wenn zwei durchhängende Tropfen in Kontakt kamen. Die hellen, inneren ovalen Reflexionen am Tropfenkontakt wurden verwendet, um den Durchmesser der Doppelschicht und die Membranfläche über die Zeit zu schätzen. Die gepaarte Impulserleichterung von null bis 60 Sekunden und gepaarte Pulsunterdrückung von 60 bis 120 Sekunden wurden mit 100-Millisekunden-Impulsen geliefert.

Die repräsentativen aktuellen Reaktionen während einer bestimmten Zeit und die Stimulationsmuster wurden aufgezeichnet. Normalisierter Strom für gramocydin-gedopte DPhPC-Doppelschichten in Hexadekan- und Dodekan-/Hexadekanölen zeigt sich während der gepaarten Pulserleichterung und gepaarten Pulssenkung. Die normalisierte Membranfläche, gemessen an 30 Zeitpunkten, zeigte eine ähnliche Flächenentwicklung in beiden Ölbedingungen trotz unterschiedlicher Strömungen.

Normalisierter Fluss trennte flächenunabhängige Änderungen der Leitfähigkeit und stimmte mit Veränderungen der Membranleitung über die einfache Flächenerweiterung hinaus überein. Eine verlängerte gepaarte Puls-Depressionsstimulation von bis zu 30 Minuten führte zu einem langfristigen depressiven Verhalten in hexadekanen Membranen, hielt jedoch einen erhöhten Fluss in Dodekan-/Hexadekan-Membranen aufrecht, was mit einem langfristigen potenzierungsähnlichen Verhalten übereinstimmt. Dieses Protokoll ermöglicht es uns, zu messen, wie sich Membranstruktur und Ionenleitung durch elektrisch gesteuerte Umstrukturierung von Tröpfchen-Interface-Doppelschichten verändern.

Diese Plattform kann viele verschiedene Stimulationsprotokolle mit Ionenkanälen, ohne Ionenkanäle und sogar photoisomerisierbare Kanäle unterstützen, um die Membrandynamik und elektrische Eigenschaften besser zu untersuchen. Da diese abstimmbare Plattform sowohl makro- als auch mikroskalige Membranbiophysik untersucht, würden zukünftige Experimente durch die Verwendung von Fluoreszenzspektroskopie zur sichereren Trennung der Proteinkanalaktivität von der Membranporenleitung erheblich verbessern.