Bau-und Implantation eines Mikroinfusion System für Nachhaltige Lieferung von Neuroactive Agents.
17. März 2008
Als neurowissenschaftliche Untersuchung wird immer anspruchsvoller, die Untersuchung von Hirnstrukturen und-Schaltung erfordert eine verbesserte Genauigkeit und eine höhere Auflösung. Wir haben ein Verfahren zur Herstellung und Implantation einer chronischen Infusion System im Gehirn unter Verwendung einer Borosilikat Mikrokanüle mit einer Spitze Durchmesser von 50 Mikrometer entwickelt.
Hallo, mein Name ist Miles Cunningham. Gemeinsam mit Ryan O'Connor und Sydney Wong werden wir den Aufbau eines Mikroinfusionssystems zur kontinuierlichen Applikation neuroaktiver Substanzen demonstrieren. Diese Arbeit wurde im Labor für Neurorekonstruktion am McLean Hospital der Harvard Medical School durchgeführt.
Wir danken der Sydney rbe Foundation und Narsad für ihre großzügige Unterstützung. Wir haben festgestellt, dass neuroaktive Wirkstoffe zuverlässig an definierte Gehirnareale über eine gezogene Bo-Silikatglasmikrokannüle mit einem Nadeldurchmesser, der fünf- bis zehnmal kleiner ist als der herkömmlicher Applikationskannülen, abgegeben werden können. Auf dieser Folie zeigen wir eine gängige Infusionskannüle aus Edelstahl neben einer Mikrokannüle, die wir hier in diesem Labor hergestellt haben.
Diese Verringerung der Größe der Applikationskanüle führt zu einer deutlichen Reduktion der Traumatisierung des untersuchten Hirnareals. Viele herkömmliche Methoden erzeugen im Wesentlichen eine Läsion im oder innerhalb des interessierenden Bereichs, wodurch die Gültigkeit jeglicher Ergebnisse fragwürdig wird. Hier in Panel A ist die Ausdehnung der Störung des lokalen Bereichs sichtbar, die durch eine 0,32 Millimeter dicke Kanüle verursacht wird, verglichen mit einer 50 Mikrometer dicken Kanüle in Panel B. Diese Aufnahmen mit geringer Vergrößerung zeigen Feuchtpräparate ungefärbter Vibram-Schnitte.
Dieselben Abschnitte wurden anschließend mit H und E gefärbt und mit höherer Vergrößerung abgebildet. Um die Verringerung der Gewebeschädigung mit der Mikrokannüle weiter zu veranschaulichen, bestehen die Komponenten des Mikroinfusionssystems aus einer Zet-Mini-Osmo-Pumpe mit ihrem Strömungsmodulator aus rostfreiem Stahl, bei dem der Flansch entfernt wurde. Zwei bis drei Zentimeter Polyethylen-Schlauch, eine speziell angefertigte BOA-Silikat-Mikrokannüle und ein 28-Gauge-Führungsdraht; dies ist das zusammengesetzte Mikroinfusionssystem, bereit zur Implantation.
Ein standardmäßiger vertikaler Pipettenzieher wird hier verwendet, um Mikrokannülen mit den gewünschten Spezifikationen herzustellen. Auch horizontale Ziehgeräte sind geeignet. Das Borosilikat-Rohr wird positioniert und fixiert, indem die Temperatur des Heizelements und die Zugkraft des Ziehers variiert werden.
Sie können Mikrokannülen mit bestimmten Durchmessern und langen, sich verjüngenden Schaftabschnitten zuverlässig reproduzieren. Das Bora-Kieselschlauchmaterial wird erhitzt und leichter Druck ausgeübt, um die gewünschte Biegung des Schlauchs zu erzielen. Diese Biegung wird in einem Abstand von der Spitze der Mikrokannüle angebracht, der für die Tiefe des gewünschten Zielareals im Gehirn geeignet ist und genügend Freiraum über dem Schädel gewährleistet.
Die endgültige Länge dieses distalen Mikrokatheterschlauchs, die Biegung, beträgt ungefähr neun bis zehn Millimeter. Offenbar mit seinem Ergebnis unzufrieden, führt Ryan die Mikrokatheterkanüle erneut ein, um eine Feinjustierung vorzunehmen und den Biegungswinkel zu perfektionieren.
Das ist viel besser mit einem Diamantschreiber. Sydney demonstriert eine Methode zum Schneiden des Borosilikatrohrs etwa fünf Millimeter proximal zur Biegung, wobei sie das Rohr fest auf einer harten Oberfläche hält, sodass der distale Teil der Mikrokaniüle frei über die Kante hängen kann. Sie ritzt das Rohr kreisförmig ein.
Dann bricht sie durch Anlegen sanften Drucks das Schlauchstück sauber an der eingeritzten Markierung. Die feine, durchsichtige Spitze der Kanüle kann anschließend mit permanentem Tinte eingefärbt werden, um die Sichtbarmachung zu erleichtern. Während des mikroskopischen Eingriffs wird die Spitze der Mikrokanüle mit einer Mikroschere auf den gewünschten Durchmesser zugeschnitten.
Der Nadeldurchmesser kann mit einem Okular oder einem Mikroskop überprüft werden. Radikale Ausrichtungsdrähte werden aus 28-Gauge-Edelstahldraht hergestellt, der in etwa drei Zentimeter lange Stücke geschnitten wird. Anschließend werden mit einer Pinzette an jedem Drahtende ein kleiner Haken von etwa zwei Millimeter Durchmesser gebogen.
Die Ausrichtungsdrähte werden zusammen mit zwei bis drei Zentimeter langen Stücken Polyäthylen-Schlauch in den Mikrokathetern in eine Petrischale gelegt. Das Mikroinfusionssystem kann mit Geräten aufgebaut werden, die in den meisten Laboren üblich sind. Mikrozangen, herkömmliche Pinzetten, chirurgische Scheren und Hämostaten werden zur Sterilisation in ein chirurgisches Tuch gelegt.
Die Instrumente, die Komponenten des Mikroinfusionssystems sowie mehrere Blätter Aluminiumfolie werden mithilfe eines Standard-Autoklaven sterilisiert. Der Flussmodulator wird vorsichtig aus seiner Verpackung entnommen und in eine sterile Petrischale gelegt. Er wird sicher mit einer Hämorrhagieklemme gehalten, und der Kunststoffflansch wird mit einer Schere vom Edelstahl-Modulatorkanal entfernt.
Die Mini-Osmosepumpe wird ebenfalls aus ihrer Verpackung entnommen und in die sterile Petrischale gelegt. Das Edelstahlrohr wird etwa zwei bis drei Millimeter in das Polyethylenrohr eingeführt und beide mithilfe eines lichtaktivierten Epoxys verbunden. Für empfindliche Arbeiten verwenden wir Lummi Bond aus unserem Neural-Labor; wir füllen eine Ein-Kubikzentimeter-Spritze mit Lummi Bond und nutzen eine 27-Gauge-Nadel als Applikator. Unter hellem Licht härtet Lumon innerhalb weniger Sekunden aus.
Die Mini-Osmosepumpe wird gefüllt, indem sie in aufrechter Position gehalten und vorsichtig mit der vom Hersteller bereitgestellten Füllnadel injiziert wird. Es wird empfohlen, das Volumen der injizierten Flüssigkeit zu beobachten und/oder die Pumpe vor und nach dem Befüllen zu wiegen, um sicherzustellen, dass die Pumpe vollständig gefüllt ist und keine Defekte aufweist. Beachten Sie, dass wir nicht empfehlen, Pumpen erneut zu verwenden.
Der vollständige Modulator mit dem daran befestigten Polyethylen-Schlauch wird anschließend in die Mini-Osmopumpe eingesetzt. Die Flüssigkeit in der Pumpe wird dabei in den Polyethylen-Schlauch gedrückt, während der Schaummodulator eingeführt wird. Der anfängliche Abschnitt des mit Flüssigkeit gefüllten Polyethylen-Schlauchs wird notiert und sollte nach Aktivierung der Pumpe durch Inkubation mit steriler Kochsalzlösung bei 39 Grad Celsius nach 12 Stunden Inkubation verlängert sein.
Die aktivierte Mini-Osmopumpe wird in sterile Kochsalzlösung getaucht, die eine luftfreie Umgebung für die letzten Schritte beim Aufbau des Mikroinfusionssystems bereitstellt. Eine Spritze, die mit dünnwandigem Kunststoffschlauch ausgestattet und mit derselben Lösung gefüllt ist, die sich in der Pumpe befindet, wird verwendet, um Luft aus dem nicht gefüllten Teil des Polyethylen-Schlauchs zu verdrängen. Beachten Sie, dass die Luft innerhalb der Mikrokannüle verdrängt werden sollte.
Ebenso kann das distale Ende des Polyäthylen-Schlauchs eine leichte Aufweitung mit einer Mikrozange erfordern, und anschließend wird das proximale Ende der Mikrokanüle eingeführt. Das gesamte System ist nun luft- und totvolumenfrei und kann aus dem Salinbad entfernt und mit steriler Gaze abgetrocknet werden. Anschließend wird Luma-Bond aufgetragen, um die Mikrokanüle an dem Polyäthylen-Schlauch zu befestigen, um die Flussrate der Mini-Osmopumpe um etwa die Hälfte zu verringern. Dazu wird sterile heiße Paraffin in eine kleine Petrischale gegossen, und die proximale Hälfte der Mini-Osmopumpe wird kurz darin eingetaucht.
Überschüssiges Paraffin wird abgeblottet und das Mikroinfusionssystem wird zurück in sterile Kochsalzlösung gestellt und bis zur Operation gelagert. Unmittelbar vor der chirurgischen Implantation wird der Führungsdraht an der Biegung der Mikrokannüle befestigt.
Die Längsachse des Führungsdrahts wird mit dem Teil der Mikrokanüle ausgerichtet, der in das Gehirngewebe eindringen wird, und mit Lumon fixiert. In dieser Position kann das Mikroinfusionssystem anschließend an einem stereotaktischen Instrumentenmanipulator positioniert werden.
Der Führungsdraht wird mit einer Manipulatorarmklemme fixiert, und die Pumpe wird von oben mit einer Schleife aus steriler Naht befestigt. Dies stützt ihr Gewicht und ermöglicht es, die Mikrokannüle durch vorsichtiges Biegen des Führungsdrahts mit einer Pinzette exakt senkrecht zur Schädelfläche auszurichten; anschließend kann das Mikroinfusionssystem mithilfe eines standardmäßigen stereotaktischen Verfahrens implantiert werden. Die Boel-Schlauchleitung wird mit Klebstoff auf der Schädelfläche fixiert.
Wir verwenden den Jaron-Mat, um ein flaches Sockelplateau zu formen. Der überschüssige Führungsdraht, der über die Präparation hinausragt, wird anschließend bündig mit der Oberfläche des Sockels abgeschnitten. Mithilfe eines Schneidrads, das an eine Hochgeschwindigkeitsbohrmaschine angebracht ist, kann die Mini-Osmopumpe dann subkutan zwischen den Schulterblättern des Tieres platziert werden.
Die vorliegende Methode bietet mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Techniken. Sie kann an die Art und das Alter des Versuchstiers angepasst werden. Das Quarzglasrohr kann der Oberfläche des Tierknochens angepasst gestaltet werden.
Daher ermöglicht die sichere, flache Fixierung und die Vermeidung der Notwendigkeit eines großen kranialen Sockels, dass die chirurgische Wunde problemlos über dem stromlinienförmigen Mikroinfusionssockel verschlossen werden kann, wodurch das Infektionsrisiko sowie die Belastung für das Tier verringert werden und zur Befestigung des Systems am Schädel weniger Oberfläche benötigt wird. Folglich können zusätzliche oder nachfolgende Eingriffe durchgeführt werden, ohne dass ein größerer Sockel stört. Am wichtigsten ist jedoch, dass diese Methode die Invasivität und Traumatisierung der lokalen Umgebung der Infusionsstelle reduziert und somit den Beobachtereffekt minimiert.
Das sind die Veränderungen, die die aktive Beobachtung am beobachteten Phänomen hervorruft.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Herstellung und Implantation eines chronischen Infusionssystems im Gehirn vorgestellt. Mithilfe einer Mikrokannüle aus Borosilikat mit einem Nadelspitzen-Durchmesser von 50 Mikrometern ermöglicht diese Technik eine verbesserte Genauigkeit bei der Applikation neuroaktiver Substanzen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Neuroengineering
- Neuropharmakologie
Hintergrund
- Fortschritte in der Neurowissenschaft erfordern präzise Methoden zur Untersuchung der Gehirnstruktur.
- Herkömmliche Abgabesysteme verfügen möglicherweise nicht über die notwendige Auflösung.
- Mikroinfusionssysteme können die Abgabe von neuroaktiven Substanzen verbessern.
- Die Forschung wurde am McLean Hospital, Harvard Medical School, durchgeführt.
Zweck der Studie
- Aufbau eines Mikroinfusionssystems demonstrieren.
- Kontinuierliche Zufuhr von neuroaktiven Substanzen zu spezifischen Hirnarealen ermöglichen.
- Genauigkeit der Applikation neuroaktiver Substanzen verbessern.
Verwendete Methoden
- Herstellung einer Mikrokanüle aus Borosilikatglas.
- Vergleich der Mikrokanüle mit herkömmlichen Infusionskanülen aus rostfreiem Stahl.
- Chronische Implantationstechniken zur dauerhaften Applikation.
- Unterstützung durch die Sydney rbe Foundation und Narsad.
Hauptergebnisse
- Microkanülen weisen einen Nadeldurchmesser auf, der 5 bis 10-mal kleiner ist als der herkömmlicher Kanülen.
- Zuverlässige Applikation neuroaktiver Substanzen an definierte Hirnareale wurde nachgewiesen.
- Erhöhte Präzision bei der Verabreichung neuroaktiver Substanzen.
- Möglichkeit verbesserte Ergebnisse in der Neurowissenschaftsforschung zu erzielen.
Schlussfolgerungen
- Das entwickelte Mikroinfusionssystem stellt einen bedeutenden Fortschritt in den Methoden der Neurowissenschaften dar.
- Verbesserte Abgabesysteme können genauere Forschungsergebnisse ermöglichen.
- Zukünftige Anwendungen könnten den Einsatz von Mikroinfusionssystemen in verschiedenen neurowissenschaftlichen Studien erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die gezielte Abgabe von neuroaktiven Substanzen an spezifische Gehirnareale ist entscheidend für die Zielstrukturnachweis und die mechanistische Ent-Risikobewertung in der neurowissenschaftlichen Arzneimittelentwicklung. Dieses Mikroinfusionssystem verringert die Invasivität und Gewebetraumatisierung und verbessert so die Datenzuverlässigkeit und die Übertragbarkeit der Ergebnisse in präklinischen Modellen. Das anpassbare, kompakte Design ermöglicht einen skalierbaren Einsatz über verschiedene Spezies und Studiendesigns hinweg und erhöht somit die Effizienz der Portfolio-Priorisierung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen mit minimalem Beobachtereffekt durch chirurgisches Trauma.
- Operativer Wert: Unterstützt die reproduzierbare Verabreichung von Wirkstoffen, um das Target-Engagement in vivo zu validieren.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet eine standardisierte Plattform für die kontinuierliche Wirkstoffapplikation in Dosis-Wirkungs-Studien.
- Operativer Wert: Erleichtert die Versuchsbereitschaft durch eine einheitliche Herstellung und Implantation von Mikrokannülen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die chronische Applikation in anatomisch präzisen Modellen und ist somit auf krankheitsrelevante Systeme ausgerichtet.
- Operativer Wert: Verringert die Variabilität durch entzündliche Reaktionen und Störgrößen durch Läsionen und verbessert dadurch die präklinische Vorhersagekraft.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in die Entdeckungsbiologie durch Hypothesenprüfung, Durchmusterung mittels quantitativer Applikation und translationale Forschung, indem sie die präklinische Kontinuität bei verringertem biologischen Rauschen unterstützt.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht eine präzise Zielvalidierung, indem störende Läsionen in den interessierenden Hirnregionen minimiert werden.
- Screening: Stellt Wirkstoffe mit hoher Reproduzierbarkeit bereit und unterstützt zuverlässige Ergebnisse bei der Verbindungsscreenings.
- Analytik: Erzeugt quantifizierbare Expositionen gegenüber neuroaktiven Wirkstoffen, was den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen erleichtert.
- Translationale Forschung: Unterstützt die Kontinuität zur präklinischen Validierung, indem chirurgische Störfaktoren reduziert werden, die Biomarkersignale verschleiern könnten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt eine wiederverwendbare Kapazität für chronische Infusionen über mehrere neuropharmakologische Projekte hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit durch verringerte mechanistische Mehrdeutigkeit infolge chirurgischer Traumata.
- Operationaler Wert: Standardisierung und Skalierbarkeit durch anpassbare Herstellung von Mikrokathetern.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen durch erhöhte Datenvalidität in Target-Validierungsstudien.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierung durch verbesserte präklinische Signal-Rausch-Verhältnisse.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Ziehen von Glas-Mikropipetten und deren formgebender Bearbeitung mittels Wärme.
- Benötigt Zugang zu einem Mikroschleifer, stereotaktischen Instrumenten und aseptischen Techniken.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg hinsichtlich Kanülenabmessungen und Implantationsprotokollen voraus.
- Erfordert Anpassungen an unterschiedliche Schädelkonturen und Zieliefen je nach Spezies.
- Eingeschränkt durch manuelle Herstellungsschritte, die die Durchsatzkapazität beeinträchtigen können, sofern keine videounterstützte Schulung erfolgt.
