Probing für Mitochondriale komplexe Aktivität in humanen embryonalen Stammzellen

Die Mitochondrien haben zahlreiche Funktionen in der Zellphysiologie, von Stoffwechsel und Energieproduktion bis hin zur programmierten Zelltodaktivierung und Synthese von Steroidhormonen. Trotz der Bedeutung von Mitochondrien sowohl für grundlegende zelluläre Funktionen als auch für Krankheiten ist bisher sehr wenig über ihre Funktion in menschlichen embryonalen Stammzellen und deren differenzierten Nachkommen bekannt. In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie die Atmungskettenkomplexe der Mitochondrien menschlicher Stammzellen mittels In-gel-Aktivitätsassays analysiert werden können.

Hallo, ich bin Ivan OV aus dem Labor von Michael Tetel am Department für Pathologie und Labormedizin der University of California Los Angeles. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Beurteilung der mitochondrialen Atmungskomplexfunktion in humanen embryonalen Stammzellen. Dieses In-Gel-Aktivitätsverfahren beinhaltet die Isolierung eines rohen mitochondrialen Lysats aus humanen embryonalen Stammzellen, die Trennung der mitochondrialen Komplexe des oxidativen Phosphorylierungssystems mittels hochauflösender Clear Native-Polyacrylamid-Gelelektrophorese sowie anschließende In-Gel-Aktivitätsnachweise.

Beginnen wir also. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien aus menschlichen embryonalen Stammzellen zu isolieren. Für diesen Assay verwenden wir menschliche embryonale Stammzellen, die unter fütterungsfreien Bedingungen auf einer mit Matrigel beschichteten Platte kultiviert wurden.

Um Mitochondrien aus unseren menschlichen Stammzellen zu isolieren, beginnen wir damit, sie mit warmer 1x-PBS, pH 7,4, zu waschen und anschließend die Zellen fünf Minuten lang mit Trypsin zu behandeln. Dabei kann man je nach Größe der Vertiefung in einer 6-Loch-Platte 1 ml 1x-Trypsin pro Vertiefung verwenden. Nach fünf Minuten kann die Reaktion durch Zugabe eines gleichen Volumens frischem Trypsininhibitor (1 Milligramm pro Milliliter in 1x-PBS) gestoppt und die Zellen geerntet werden.

Die gesammelten Zellen werden anschließend bei 200 × g für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand verworfen und das Zellenpellet in 0,8 bis 1,7 Milliliter eiskaltem Mitochondrien-Isolierpuffer mit einer frisch zubereiteten Cocktailslösung aus 1× Proteaseinhibitor resuspendiert. Die Menge des verwendeten Puffers hängt von der Größe des erhaltenen Zellenpellets ab. Nachdem das Pellet resuspendiert wurde, wird es etwa 10 Minuten auf Eis inkubiert.

Nach der Inkubation lysieren wir die Zellen mit einem Homogenisator, was etwa 40 bis 50 Stöße erfordern kann. Wir können die vollständige Homogenisierung überprüfen, indem wir ein Aliquot der DOD-Zellen mit Trypanblau färben und unter einem Lichtmikroskop betrachten. Es sollte etwa so aussehen.

Dies ist die erste Probe nach 50 Stößen mit einem Down. Dies ist die zweite Probe nach 80 Stößen mit einem Down. Sobald die Zellen homogenisiert sind, zentrifugieren Sie sie bei 20.000 ×g für 10 Minuten bei vier Grad C. Dies liefert uns ein rohes mitochondriales Pellet, das auch Kerne und größere Zellfragmente enthält.

Vor der Sammlung des Pellets muss das Sammelröhrchen gewogen werden, um das anschließende Pelletgewicht zu bestimmen, der Überstand abgegossen und verworfen werden, und anschließend das präzipitierte, rohe mitochondriale Pellet gewogen werden. Indem man zu diesem Zeitpunkt das Gewicht des Röhrchens subtrahiert, kann man mit der Auflösung des Pellets fortfahren, was im nächsten Schritt gezeigt wird. Um das rohe mitochondriale Pellet aufzulösen, beginnen wir damit, das Pellet auf Eis zu lagern und mit 35 µL eiskaltem Solubilisierungspuffer zu vortexen.

Für jeweils 20 Milligramm Pellet, zu denen detaillierte Angaben über die Pufferzusammensetzung im beigefügten schriftlichen Protokoll enthalten sind. Nach dem Wirbeln und Zugabe des Solubilisierungspuffers, aber vor der Zugabe von Digitonin, überführen wir den resuspendierten Pellet in ein für Hochgeschwindigkeitszentrifugation geeignetes Röhrchen und geben anschließend 20 Mikroliter 10 %iger (Gewicht pro Volumen) Digitonin-Lösung pro 20 Milligramm Pelletmasse hinzu. Nach dem Mischen durch vorsichtiges Anstupsen des Röhrchens wird der mitochondriale Pellet gründlich vermischt und für fünf bis zehn Minuten auf Eis inkubiert. Doil-beta-D-Multisid oder DDM beziehungsweise Triton X-100 können als Alternative zu Digitonin zur Proteinsolubilisierung verwendet werden.

Die Wahl des Detergens und dessen Menge kann die Bildung supramolekularer Komplexe oder multimerer Formen mitochondrialer Komplexe nach der Inkubation auf Eis beeinflussen. Und sobald das Pellet solubilisiert wurde, zentrifugieren wir es bei hunderttausend ×g für 15 Minuten bei vier Grad C und sammeln anschließend den klaren Überstand. Nun sind wir bereit, den Überstand für den Lauf in unserem Gradientengel vorzubereiten, um eine native Gradientengelelektrophorese von Mitochondrien durchzuführen.

Es wird empfohlen, ein Acrylamid-Gradienten-Gel von fünf bis 13 % mit einem 3,5 %igen Übertragergel zu verwenden. Zur Herstellung des Gels verwenden wir eine Acrylamid-Bis-Acrylamid-Mischung, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Die Acrylamid-Bis-Acrylamid-Lösung wird im Voraus hergestellt und bei vier Grad Celsius an einem dunklen Ort aufbewahrt.

Acrylamid und Bis-Acrylamid sind toxische Chemikalien, sowohl als Pulver als auch in flüssiger Form, weshalb besondere Vorsicht geboten ist, wenn mit ihnen gearbeitet wird. Wir kombinieren die Acrylamid-Bis-Acrylamid-Lösung mit einem Aliquot aus einem dreifachen Gel-Puffer, der aus 1,5 Molar 6-Aminohexansäure und 75 Millimolar Ole bei pH 7,0 besteht. Die Menge an Acrylamid-Bis-Acrylamid-Lösung, die wir dem Puffer hinzufügen, hängt vom gewünschten Prozentsatz des Gels ab, um das Gradientengel herzustellen.

Wir stellen eine 4 %ige Mischung und eine 13 %ige Mischung her, und das Stapelgel wird eine 3,5 %ige Mischung sein. Vergessen Sie nicht, der 13 %igen Mischung Glycerin hinzuzufügen. Wenn alle drei Mischungen bereit sind, geben wir eine geeignete Menge Ammoniumpersulfat und TEMED zu den Mischungen hinzu und füllen die Mischungen in eine Gelperfusionskammer für Gradienten.

Der linke Teil der Kammer enthält das 5%ige Gemisch. Der rechte Teil der Kammer enthält das 13%ige Gemisch zusammen mit einem kleinen magnetischen Rührstab. Wir beginnen, das Gel einzugießen, indem wir den rechten Teil der Kammer öffnen.

Dann öffnen wir umgehend den linken Teil der Kammer und lassen die 5%-Lösung mit einer 13%-Lösung vermischen, um den Gradienten zu erzeugen. Wir geben eine kleine Menge Isopropanol auf die Oberseite des Gels, um nach der Polymerisation eine scharfe, gerade Grenzfläche des Gels zu bilden. Etwa eine Stunde später, wenn die Polymerisation des Gradientengels abgeschlossen ist, entfernen wir das Isopropanol und geben das 3,5%-Stapelgel in die Apparatur, anschließend setzen wir einen Kamm ein.

Wir werden die Gele in einem Kühlraum mit einer Temperatur von etwa vier bis sieben Grad Celsius zusammenbauen und laufen lassen. Für den Lauf dieses Gels verwenden wir zwei verschiedene Puffer. In der Anodenkammer setzen wir einen Puffer ein, der 25 Millimolar Ole-Hydrochlorid-Puffer, pH 7,0, enthält.

Der Kathodenpuffer enthält 50 Millimolar Tric, 7,5 Millimolar Ole-Hydrochlorid, 0,02 % Gewicht pro Volumen Doil-Beta-D-Multisid oder DDM und 0,05 % Gewicht pro Volumen Deoxycoat, pH 7,0. Um das Supernatant vorzubereiten, das in das soeben gegossene Gel eingebracht wird, wird Lade-Puffer hinzugefügt, um eine Endkonzentration von 5 % Gewicht pro Volumen Glycerin und 0,01 % Gewicht pro Volumen Ponto S zu erreichen. Üblicherweise geben wir eine 10×-Stammlösung, die Glycerin und Poncho S enthält, direkt zu den Supernatants.

Nun sind wir bereit, die Proben auf das Gel aufzutragen. Wir beladen die Gelltaschen mit einem Volumen, das 20 bis 40 Milligramm des rohen mitochondrialen Proteins pro Lane enthält. Unmittelbar nach dem Beladen wird das Gel bei 100 Volt durchlaufen.

Wenn die Probe in das Stapelgel eingetreten ist, kann die Spannung auf 500 Volt erhöht werden, wobei der Strom auf 15 Milliampere begrenzt bleibt. Obwohl wir das Gel normalerweise über Nacht bei 70 bis 100 Volt laufen lassen, beenden wir die Elektrophorese, sobald sich eine scharfe Linie des roten Zos-Farbstoffs der Vorderkante des Gels nähert. Nachdem das Gel durchgelaufen ist, können wir die Aktivität der verschiedenen Protein-Komplexe direkt im Gel analysieren.

Die Inkubationszeit für jeden Assay hängt von der Effizienz der Proteinsolubilisierung und der Menge des pro Wellen eingebrachten Materials ab. Komplex 1, 4 und 5 erzeugen gewöhnlich stärkere Signale als Komplex 2 und 3. Aus diesem Grund sollte die Färbezeit für Komplex 2 und 3 länger sein.

Um die Aktivität der Komplexe zu testen, müssen wir spezifische Puffer für jeden Komplex verwenden. Die Bestandteile der einzelnen Puffer finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nun schneiden wir die einzelnen Gelläden aus, um die In-Gel-Aktivitätsanalysen separat durchzuführen.

Für alle Komplexe inkubieren Sie den Gelausschnitt mit Ausnahme von Komplex fünf mehrere Stunden bei Raumtemperatur in den jeweiligen Puffern. Nach der Inkubation fixieren Sie das Gel 15 bis 45 Minuten lang in 50 % Methanol und 10 % Essigsäure. Das fixierte Gel wird in 10 % Essigsäure aufbewahrt.

Sie sehen hier, wie die Färbung des Komplexes I erscheint. Es gibt ein tiefviolett gefärbtes Band im Gelschnitt, das dem Komplex I entspricht. Klare Gele ermöglichen die Densitometrie der mitochondriale Komplexe und vergleichende Analysen.

Nach der dichten Zytometrie trocknen wir die Gele oft zur Langzeitlagerung und/oder zum Scannen, um ein hochwertiges Bild zu erhalten. Zwei Komplexe färben sich dabei in derselben violetten Farbe, nämlich Komplex drei und Komplex vier. Beide zeigen ein orange- oder gelblich gefärbtes Band. Hier sind Beispiele für die Färbeaktivitäten von Komplex zwei, drei und vier.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man die Aktivität von mitochondrialen Exsudat-Ations-Komplexen analysiert, die aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnen und mittels hochauflösender nativer Gelelektrophorese getrennt wurden. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.