Neutrophile Isolation Protocol

Protokoll zur Isolierung von Neutrophilen. Dieses Verfahren dient der Gewinnung von weißen Blutkörperchen aus einer Vollblutprobe mithilfe einer Zentrifuge und von Vials. Vortex sir Spritze und Spritzenfilter.

Millipore-Filter der Marke MX gv 0,22 Mikrometer Materialien. Für die Neutrophilenseparation nach Hank ist eine Salzlösung erforderlich, die zwei Arten von HBSS-Lösungen benötigt. HBSS mit Calciumchlorid wird verwendet, um eine Lösung mit menschlichem Serumalbumin herzustellen.

HBSS ohne Calciumchlorid wird zum Suspendieren und Waschen der Neutrophilen verwendet. Achten Sie darauf, in diesem Verfahren die geeignete HBSS-Lösung zu verwenden. Humanes Serumalbumin oder HSA ist ein Protein im Blutplasma, das den pH- und den osmotischen Druck aufrechterhält.

Verwenden Sie kein bovines Serum-Amalgam-Roten-Blood-Zell-Lysepuffer. Dieser wird von Roche Diagnostics hergestellt, Neutrophilen-Isolationsmedium NIM Cedar Line Labs Lymph-Leicht-Poly-Trennmedium, vor Licht geschützt und zur Erzielung bester Ergebnisse im Kühlschrank aufbewahrt. Alle Reagenzien sollten zum Zeitpunkt der Verwendung Raumtemperatur haben.

Entfernen Sie die Reagenzien eine Stunde vor dem Experiment aus dem Kühlschrank. Bereiten Sie die H-B-S-S-H-S-A-Lösung zur Neutrophilenseparation vor. Pipettieren Sie HBSS mit Calciumchlorid in ein Gefäß.

Ziehen Sie HSA in die Spritze. Vermeiden Sie das Eindringen von Luftblasen. Entfernen Sie die Spritzennadel und ersetzen Sie sie durch den Filter.

HSA durch einen Filter in ein HBSS-Fläschchen injizieren und kurz vortexen, um es zu mischen. Sobald die anderen Materialien bereitliegen und Raumtemperatur erreicht haben, etwa 15 Milliliter Vollblut gewinnen. Dies ergibt 10 bis 15 Milliliter mit einer Konzentration von 10⁸ Neutrophilen. Der Spender sollte in den 24 Stunden vor der Blutentnahme keinen Alkohol oder rezeptfreie Arzneimittel konsumiert haben.

Diese können den Trennprozess stören. Vollblut kann mit EDTA-Zitrat oder Heparin antikoaguliert werden, indem neun Teile Blut mit einem Teil K3-EDTA-Natriumzitrat oder Heparin gemischt werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die folgenden Schritte werden in diesem Verfahren beschrieben.

Plasma und Monozyten trennen und entfernen. Einen Neutrophilen-Pellet gewinnen, indem rote Blutkörperchen lysiert und die Neutrophilen in der ersten Trennung frei suspendiert werden. Neutrophile in der NIM-Schicht gewinnen.

Sammeln Sie fünf Milliliter Isolationsmedium in einem Zentrifugenröhrchen. Wenn das Isolationsmedium weiter unten im Röhrchen platziert wird, wirkt es als Filter, da die Zentrifugation das Blut vorsichtig hindurchzwingt. Schichten Sie fünf Milliliter Blut vorsichtig über das NIM, um eine saubere Trennung zu erzielen.

Seien Sie sehr vorsichtig, um eine Vermischung der Lösungen zu vermeiden. Führen Sie diesen Schritt langsam und sorgfältig durch, wobei die Pipettenspitze nahe an der Oberfläche des Auflösemediums gehalten werden sollte, um eine Vermischung während der Zentrifugation zu verhindern. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 500 RCF für 35 Minuten.

Bei 20 bis 25 Grad Celsius sollte sich das Blut in sechs deutliche Bänder aufteilen. Die sechs Bänder sind Plasma, Monozyten, Isolationsmedium, Neutrophile, weiteres Isolationsmedium und das Erythrozyten-Pellet am Boden. Wenn diese sechs Bänder nicht klar und deutlich sichtbar sind, war der Trennungsprozess nicht sauber und müsste wiederholt werden.

Zu den häufigen Ursachen für eine schlechte Trennung gehören veraltete Isolationsmedien, Spender, die in den letzten 72 Stunden Alkohol konsumiert haben, oder Spender, die andere Medikamente wie Tylenol oder Aspirin eingenommen haben. Vorsichtig das Plasma, die Monozyten und das Isolationsmedium entfernen und verwerfen. Diese Schichten in ein verschließbares Röhrchen geben und sorgfältig die Schicht der Neutrophilen sowie das gesamte darunterliegende Isolationsmedium in eine saubere Zentrifugenröhrchen pipettieren, um möglichst viele Neutrophile zu gewinnen.

Es ist oft am einfachsten, etwas vom Isolationsmedium aus der darunterliegenden Schicht mitaufzunehmen. Stören Sie das Pellet am Boden nicht. Zweite Abnahme, Neutrophilen-Schicht reinigen.

Verdünnen Sie die Neutrophilen-Lösung mit HBSS ohne Calcium auf 10 Milliliter. Invertieren Sie das Röhrchen mehrmals, um die Zellen zu suspendieren, und zentrifugieren Sie die Neutrophilen-Lösung.

350 × g für 10 Minuten. Bei 20 bis 25 Grad Celsius sollte ein rotes Pellet am Boden des Röhrchens vorhanden sein, das Neutrophile und verbleibende rote Blutkörperchen enthält. Entfernen Sie den Überstand mit der Pipette.

Seien Sie vorsichtig, um das Pellet am Boden nicht zu stören. Lyse der roten Blutkörperchen.

Die roten Blutkörperchen in der Probe müssen nun durch Lyse zerstört werden. Um die verbleibenden roten Blutkörperchen zu lysieren, geben Sie zwei Milliliter Puffer zur Lyse roter Zellen in das Röhrchen, um die Probe erneut aufzuschwemmen. Suspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Gefäß bei einer Einstellung von drei bis vier verwirbeln.

Vermeiden Sie, die Wirbelstärke auf mehr als vier zu erhöhen, da dies die Aktivierung der Neutrophilen verursachen kann. Es kann erforderlich sein, mehrere Sekunden zu wirbeln oder den Wirbel kurzzeitig einzuschalten, um das Pellet aufzulösen. Zentrifugieren Sie die Lysepufferlösung bei 250 RCF für fünf Minuten.

Verwenden Sie die Sanftanlauf-Funktion, um Schäden an der Probe zu minimieren. Entfernen Sie das Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie den Lysevorgang.

Falls erforderlich, suspendieren Sie die Neutrophilen, indem Sie 500 Mikroliter HBSS ohne Calcium zu jedem Röhrchen hinzufügen. Vortexen Sie das Pellet auf einer Stufe von drei bis vier, verdünnen Sie es mit HPSS ohne Calcium auf 10 Milliliter und zentrifugieren Sie die Neutrophilen bei 250 RCF für fünf Minuten. Aspirieren und verwerfen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie das Pellet zweimal in 250 Mikrolitern HBSS mit HSA-Lösung; typischerweise werden zwei mal zehn hoch sechs Neutrophile pro Milliliter gesammelt.