Trypsinizing und Subkultivierung Säugerzellen

Die Zellkultivierungstechnologie hat im Bereich der Zellbiologie breite Anwendung gefunden. Kultivierte Zellen erfordern jedoch regelmäßige Pflege, um gesund zu bleiben. Wenn die Zellen Konfluenz erreichen, müssen sie unterteilt oder passagiert werden.

Die Nichteinhaltung führt zu vermindertem Wachstum und letztendlich zum Zelltod. In diesem Video zeigen wir, wie man Gewebekulturzellen sowohl für anheftungsabhängige als auch für Suspension-Zelllinien pflegt. Hallo, ich bin Ricky aus dem Labor von Dr. LAN bei den Molecular Pathology Laboratories Network in Ost-Tennessee.

Heute möchte ich Ihnen zwei Techniken zur Aufbereitung von Suspension- und Adhäsionszellen zeigen. Um Zellen zu passagieren, beginnen wir mit einer Primärkultur, die bis zur Konfluenz in einer 60 Millimeter großen Petrischale oder einem 25 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben mit fünf Milliliter Zellkulturmedium gezüchtet wurde.

Wir beginnen damit, das gesamte Medium der Primärkultur mit der sterilen Pipette zu entfernen. Anschließend waschen wir die anhaftende Zellmonoschicht ein- bis zweimal mit einem geringen Volumen an HBSS bei 37 Grad Celsius ohne Calcium und Magnesium. Dies dient dazu, restliches fetalen Kälberserum zu entfernen, das die Wirkung des Trypsin-Enzyms hemmen könnte, das im nächsten Schritt hinzugefügt wird.

Fügen Sie anschließend genügend warme Trypsin-EDTA-Lösung zur Kultur hinzu, um die anhaftende Zellschicht vollständig zu bedecken. Danach können Sie die Platte für ein bis zwei Minuten auf ein Wärmetablett mit 37 Grad Celsius stellen. Nach der Inkubation klopfen Sie vorsichtig auf den Boden der Platte, die auf einer flachen Oberfläche steht, um die Zellen zu lösen.

Überprüfen Sie die Kultur mit einem umgekehrten Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen aufgerundet sind, was darauf hinweist, dass sie sich von der Oberfläche gelöst haben. Falls die Zellen nicht ausreichend abgelöst sind, stellen Sie die Platte für eine zusätzliche Minute oder zwei auf das Wärmetablett zurück. Nach der Kontrolle durch das Mikroskop spülen Sie die Schale mit komplettem Medium aus und pipettieren die Suspension in ein 15-mil-konisches Röhrchen, das zwei Mils komplettes Medium enthält.

Zentrifugieren Sie die Zellen, um sie zu pelletieren, und resuspendieren Sie das Pellet in komplettem Medium. Geben Sie nun ein gleiches Volumen der Zellsuspension in jede der frischen, entsprechend beschrifteten Platten. Alternativ können die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und auf die gewünschte Dichte verdünnt werden, sodass eine bestimmte Anzahl von Zellen in jede Platte gegeben werden kann.

Beschriften Sie jede Platte unbedingt mit dem Datum der Subkultur und der Passagezahl. Geben Sie nach Zugabe der Zellsuspension je ein Mil frisches Medium zu jeder neuen Kultur. Inkubieren Sie die Platten nun in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Nachdem Sie die Zellen über Nacht inkubiert haben, fügen Sie frisches Medium zu den Platten hinzu und stellen Sie sie wieder auf 37 Grad. Sobald die Platte konfluent gewachsen ist, können Sie die Platte erneut passagieren, indem Sie dieses Verfahren wiederholen, und bei Bedarf weiterhin passagieren. Nun zeigen wir Ihnen, wie man Zellen in Suspensionkultur passagiert.

Die Verpackung von Zellen in Suspensionkultur ist einfacher als die von Anheftungszellen. Vor der Verpackung müssen Suspensionkulturen alle zwei bis drei Tage mit Nährmedium versorgt werden, bis sie konfluent sind, was bedeutet, dass sich die Zellen in der Suspension zusammenlagern und das Medium trüb erscheint, wenn man das Kolbenmedium schwenkt.

Führen Sie dies durch, indem Sie die Kolben mit den Suspensionzellen aus dem Inkubator nehmen und darauf achten, dass die Zellen, die sich am Boden des Kolbens abgesetzt haben, nicht gestört werden. Unter aseptischen Bedingungen entfernen und entsorgen Sie etwa ein Drittel des Mediums aus dem Kolben und ersetzen Sie es durch ein gleiches Volumen vorgewärmten Mediums bei 37 Grad Celsius. Nach dem Mediumwechsel schwenken Sie den Kolben und stellen Sie ihn zurück in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.

Befindet sich weniger als 15 ml Medium im Kolben, inkubieren Sie den Kolben in horizontaler Position, um den Kontakt zwischen Zellen und Medium zu verbessern. Andernfalls kann der Kolben an den Tagen, an denen die Kulturen nicht versorgt werden, senkrecht inkubiert werden. Überprüfen Sie sie, indem Sie die Kolben vorsichtig schwenken, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen.

Achten Sie darauf, eventuelle Farbänderungen des Mediums zu beobachten, die auf ein gutes metabolisches Wachstum hinweisen. Sobald die Kulturen konfluent sind, was etwa 2,5 Millionen Zellen pro Mil entsprechen sollte, können Sie sie weitergeben. Nochmals: Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man Zellkulturen sowohl von Anheftungskulturen als auch von Suspensionkulturen weiterpasagiert.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.