Interview: Bioreaktoren und Aufgetaucht-Modified 3D-Gerüste für Stammzellforschung

Mein Name ist Karlan und ich arbeite als Biophysiker am Institut für Biologische Grenzflächen. Am Cal Screw Institute of Technology entwickeln wir Bioreaktoren und oberflächenmodifizierte dreidimensionale Gerüste zur Kultivierung funktioneller Gewebe und für die Stammzellenforschung. Dabei interessieren wir uns hauptsächlich für die Wechselwirkung von Zellen mit ihrer künstlichen Umgebung. Ein Leitartikel in Nature stellte 2003 die Frage „Flat Biology“ – und die Frage lautet: Was wird damit gemeint?

In der Vergangenheit wiesen viele in-vitro-Kultursysteme, hauptsächlich Monolayer-Kulturen, Nachteile auf, beispielsweise dass differenzierte primäre Zellen eine relativ kurze Lebensdauer hatten und sich während der Kultur dedifferenzierten. Das bedeutet, dass sie sehr schnell den Großteil ihrer organspezifischen Funktionen verloren. Daher wurden zahlreiche unterschiedliche Modifikationen und Anpassungen an konventionellen Monolayer-Kulturen vorgenommen, um in vitro bessere Bedingungen für diese Zellen zu schaffen.

Und dazu gehören die Zusammensetzung des Kulturmediums und die Beschichtung der Kulturgefäße, in denen die Zellen vorwiegend Monolagen bilden. Alle diese Ansätze verdeutlichen die Bedeutung von Zell-Matrix-Interaktionen sowie der Kommunikation zwischen Zellen. Ein weiterer wichtiger Aspekt scheint die Schaffung zelltypspezifischer Kontexte zu sein, die beispielsweise durch Gap-Junction-Komplexe realisiert werden, ein gemeinsames Merkmal vieler Zellen im lebenden Organismus.

In konventionellen Monolayer-Kulturen geht die Kommunikation über Gap-Junctions schnell verloren. Über einen langen Zeitraum war es möglich, in vitro bis zu einem gewissen Grad eine gewebelike Anordnung von Zellen mithilfe der sogenannten Steroid-Technik wiederherzustellen.

Ein Beispiel aus unserem Labor zeigte, dass sogar adulte ru-Hepatozyten Steroide bilden können und in diesen Aggregaten mindestens wochenlang vital bleiben. Die Hepatozyten bleiben in engem Kontakt zueinander, was die zelluläre Kommunikation fördert und zur Stabilisierung hepatozytenspezifischer Funktionen führt. Wir stellten jedoch auch fest, dass diese konventionelle dreidimensionale Kulturmethode mehrere Nachteile aufweist.

Die Größe der Aggregate ist entscheidend. Sie können bei großen Aggregatdurchmessern Nekrosen hervorrufen, und in den meisten Fällen ist das Verhältnis von Mediumvolumen zu Zellzahl ungeeignet. Außerdem können Scherkräfte und Rührkulturen problematisch sein.

Organe und Gewebe in lebenden Organismen zeichnen sich unter anderem durch eine sehr hohe Zelldichte aus; außerdem ist der gezielte aktive Transport von Substanzen durch diese Gewebeschichten ein wichtiges Merkmal. Daher sollten realistische organotypische In-vitro-Gewebemodelle diese natürliche Architektur so genau wie möglich nachbilden. Ein wesentlicher Faktor, der solche Systeme begrenzt, ist das geeignete Verhältnis von Medium- zu Zellvolumen.

Ich habe bereits erwähnt, dass wir ein geeignetes Zellgehäuse entworfen haben, das als präzise mikrostrukturiertes Polymerscaffold gestaltet ist und gleichmäßig dimensionierte Behälter für die dreidimensionale Kultur von Zellaggregaten bietet. Für das Polymerscaffold verwenden wir vorzugsweise PMMA oder PC Polyether, Polycarbonat. Dieses besteht aus einer mikrostrukturierten plantaren Vorrichtung mit einer Fläche von einem Quadratzentimeter, die ein dichtes Array von mehr als 1000 dieser Behälter bietet.

Für die dreidimensionale Kultur von Zellaggregaten hat sich gezeigt, dass sie für die 3D-Zellkultur über mehrere Wochen geeignet ist. Jeder dieser kleinen würfelförmigen Behälter im Array weist eine Kantenlänge von etwa 300 Mikrometern auf. Das besondere Design dieses Gerüsts und der Peripherie, das heißt der Inkubationskammer.

Das ektorale Medium und die Gasversorgung ermöglichen verschiedene Modi der Mediumzufuhr. Erstens die Superfusion, bei der beide Seiten des Gewebes separat mit Nährmedium versorgt werden, und zweitens die Perfusion.

Dadurch wird der mittlere Durchfluss zur Penetration der Gewebeschicht gezwungen. Der Perfusionsmodus kann verwendet werden, um Bedingungen zu schaffen, die die in-vivo-Vaskularisierung besser nachahmen; jedoch ist sogar ein gemischter Modus aus Perfusion und Superfusion möglich. Verschiedene Generationen von Zellkammern wurden entwickelt.

Jede Generation kann mit einem bestimmten Design verwendet werden, um die Anforderungen einer speziellen Anwendung zu erfüllen. Beispielsweise wurden Designs von Einzel- und Doppelschiff-Bioreaktoren ebenso realisiert wie separat ansteuerbare Multititer-Anordnungen oder hochparallelisierte Varianten. Für die letzte Generation dieser verschiedenen Formen, die sogenannten mikrothermogeformten Behälter, wurde eine bestimmte Technologie entwickelt, die die zusätzliche Möglichkeit bietet, die gesamte Oberfläche dieser dreidimensional geformten Behälter zu modifizieren, wodurch sogar eine Oberflächenmusterung im Submikrometerbereich mit Signalmolekülen möglich ist.

Außerdem können Sensoren und Signalelektroden integriert werden. Die Anwendungen reichen von der Grundlagenforschung und Zellbiologie bis hin zur Toxikologie und Pharmakologie, sowie möglicherweise Hochdurchsatz-Screening. Ein sehr wichtiger Punkt am Schluss ist die Tatsache, dass die letzte Generation unserer Mikrothermoformchips dahingehend optimiert wurde, Verfahren für eine kostengünstige Massenproduktion zu ermöglichen und somit die Anwendung in anderen Laboren zu erlauben.