Interview: HIV-1 Provirus-DNA Excision Mit einem Evolved Rekombinase

Ich bin JohE Hvar und befinde mich am Institut für Zellbiologie und Biologie des HE Pet Instituts in Hamburg, Deutschland. Das HE PET Institut ist ein Institut für Grundlagenforschung, das sich ausschließlich auf humane, pathogene Viren und damit verbundene Fragestellungen konzentriert, würde ich sagen. Unsere Abteilung interessiert sich hauptsächlich dafür, die Regulation der HIV-Genexpression zu untersuchen sowie die insbesondere intrazellulären Wechselwirkungen von HIV mit Bestandteilen der Wirtszelle.

Basierend auf diesen Daten versuchen wir außerdem, neue experimentelle Therapien gegen die HIV-Erkrankung zu entwickeln. Das Problem bei HIV ist, dass HIV ein Retrovirus oder Lentivirus ist und wie jedes Retrovirus integriert es nach der Infektion der Wirtszelle das virale Genom in das Genom der Wirtszelle. Bislang kann man den integrierten Provirus nicht mehr beseitigen.

Das bedeutet, was die Therapie betrifft, dass wir es bei dieser Krankheit um eine chronische Erkrankung mit lebenslanger Therapie zu tun haben und damit grundsätzlich um all die mit lebenslangen Therapien verbundenen Probleme wie Nebenwirkungen der Medikamente, Auftreten von Resistenzen und so weiter. Nun kennen wir aus der Grundlagenforschung seit vielen Jahren sogenannte Rekombinasen, die natürlich in Rekombinationsvorgängen beispielsweise in Hefe oder in Bakterien vorkommen. Diese Rekombinasen erkennen spezifische DNA-Sequenzen, vertauschen Gene und reorganisieren das Genom und so weiter.

Und insbesondere eine Rekombinase namens decre-Rekombination wird in der Grundlagenforschung und der situ in der Grundlagenforschung verwendet. CRE erkennt im Wesentlichen seine spezifische Sequenz. Und wenn sich eine Sequenz zwischen zwei Erkennungsstellen befindet, kann CRE die dazwischenliegende Sequenz im Wesentlichen herausschneiden.

Die Idee, das Virus zu eliminieren, stammt bereits seit 10 oder 15 Jahren aus der Medizin, und auf der anderen Seite rekombinierende Enzyme wie beispielsweise Grief einzusetzen, um das provirale DNA zu entfernen. Dies sollte theoretisch möglich sein, da HIV nach der Infektion sein RNA-Genom mittels Reverse Transkriptase in DNA umschreibt und durch diesen Prozess der Reverse Transkription sogenannte lange terminale Wiederholungssequenzen (long terminal repeats, LTRs) entstehen, die im Wesentlichen das 5′-Ende beziehungsweise den Anfang und das 3′-Ende, die Grenze des integrierten proviralen DNA markieren. Theoretisch könnte man also eine Rekombinase entwickeln, die spezifisch eine Sequenz in den LTRs erkennt; diese Rekombinase würde dann das 5′-Ende und das 3′-Ende des integrierten proviralen DNA angreifen, die DNA herausschneiden und somit das Virus aus der infizierten Zelle vollständig beseitigen. Das Problem bei HIV besteht nun darin, dass es verschiedene Isolate gibt, möglicherweise sogar innerhalb einer einzelnen Person, eines einzelnen Patienten. Insbesondere wissen wir jedoch bisher, dass die Sequenz am Anfang und am Ende des Virusgenoms konserviert ist.

Das bedeutet also, dass die LTRs stärker konserviert sind als beispielsweise die HIV-Gene. Ich denke daher, dass gute Chancen bestehen, mit nur einer geringen Anzahl von Rekombinasen auszukommen, die im Wesentlichen die überwiegende Mehrheit aller HIV-Isolate erkennen. Und falls nicht, müssten wir einfach eine neue durch molekulare Evolution erzeugen, was in Zukunft halbautomatisiert möglich sein könnte.

Und es wird, der Prozess wird viel schneller sein, als dies im Labor durchzuführen. In unser Kollege, Dr. Frank vom Max-Splunk-Institut, kam ins Spiel. Grundsätzlich ist er Experte für Rekombinasen und alles dazwischen.

Grundsätzlich verwendet er, was wir als molekulare Evolutionsmethode bezeichnen. Diese Methode basiert jedoch auf der PCR-Kettenreaktionstechnologie. Er nimmt das Gen der natürlich vorkommenden Rekombinase Degree Combs und richtet PCR- oder mehrere PCR-Reaktionen unter Bedingungen ein, die zufällig Mutationen einführen.

Der Trick besteht nun darin, die neuen Versionen der Rekombinase auszuwählen, die eine neue Fähigkeit oder Aktivität erworben haben, nämlich die Erkennung HIV-spezifischer Sequenzen. Dies geschieht in sich wiederholenden Zyklen. Er benötigte etwa 120 oder mehr als 120 Zyklen, um diese Art von molekularer Evolutionstechnik durchzuführen.

Als er schließlich diese spezifische, heute als drei bezeichnete LTR-spezifische Rekombinase mit dieser neuen Rekombinase entwickelte, die nun gezielt HIV-Sequenzen erkennt. Die anfängliche Studie erfolgte hier; die Experimente mit den Rekombinasen wurden am HE PET-Institut in Hamburg durchgeführt. Insbesondere übertrugen wir diese Rekombinase mithilfe von Vektoren, Genvektoren, in humane Zellkulturen, die zuvor mit einem mehr oder weniger klinischen Isolat von HIV-1 infiziert worden waren.

Und im Laufe der Zeit, über sechs bis acht Wochen, konnten wir dies nachweisen. Der rekombinante Ansatz ist quantitativ gesehen aufregend; sie integrierten das HIV-Profil DA, im Grunde wird die gesamte Kultur geheilt, indem HIV beseitigt wird. Bei dieser Technologie gibt es mit Sicherheit zahlreiche Probleme.

Zunächst müssen wir sicherstellen, dass die Expression der Rekombinase keine toxischen Nebenwirkungen verursacht. Wir erwarten dies nicht, da es für natürliche Rekombinationen wie gre sogenannte transgene Tiere gibt. Diese exprimieren die GRE-Rekombinase, und obwohl es einige Probleme gibt, sind diese nicht allzu gravierend.

Ich darf das an dieser Stelle erwähnen. Es besteht also Hoffnung, dass keine toxischen Nebenwirkungen auftreten, aber man kann es nie sicher wissen, bevor man die Experimente durchgeführt hat. Außerdem gibt es Probleme, dass wir möglicherweise nicht jeden klinischen Isolat damit erkennen könnten, sodass wir den dominanten Isolat, den HIV-Isolat bei einem Patienten, nicht vollständig eliminieren können.

Doch im Laufe der Zeit werden wir aus einem geringfügigen, geringfügigen Isolat auswählen. Das wissen wir nicht; wir müssen diese Experimente durchführen. Dann gibt es ein großes Problem mit der Genübertragung, mit der Vektortechnologie.

Wir müssen sogenannte lentivirale Vektoren oder auch retrovirale Vektoren verwenden, um das Gen oder das Rekombinasen-Gen zu übertragen. Gibt es dabei Nebenwirkungen? Gibt es, verursachen diese Vektoren toxische Effekte?

Das sind alle Fragen, die wir haben. Außerdem hoffen wir, die Aktivität der Kämme zu verbessern. Sie, die Rekombination, wirkt einfach schneller, als wir sie momentan über einige Wochen hinweg beobachten können, die Aktivität.

Daher handelt es sich hierbei um offene Fragen, die wir in den kommenden Jahren bearbeiten müssen. Und dies ist derzeit sicherlich ein Problem, da Rekombinasen nicht oral verfügbar sind. Es wird also keine Pille geben, keine Rekombinase-Pille, mit der man einfach das Virus loswird.

Spekulieren wir also über zukünftige Therapien, müssen wir über gentherapeutische Ansätze nachdenken. Vielleicht könnte man sich vorstellen, dass wir sogenannte hämatopoetische Stammzellen oder CD34-positive Zellen aus dem Blut von HIV-infizierten Patienten isolieren. Anschließend bringen wir im Labor das Gen für die Kämme in diese Zellen des Patienten ein.

Schließlich führen wir die Zellen des Patienten erneut ein, wir reinfundieren die genetisch veränderten Zellen desselben Patienten zurück in dessen Körper. Das Ziel ist, dass sich das Immunsystem bzw. das hämatopoetische System des Patienten im Laufe der Zeit zumindest teilweise mit Zellen neu aufbaut, die nach einer HIV-Infektion in der Lage sind, das Virus zu eliminieren, da sie nun eine Rekombinase exprimieren. Die Folge wäre, dass die Viruslast beim Patienten abnimmt und sich die Lebensqualität sicherlich verbessert.

Und wir können auch hoffen, dass das Immunsystem bei diesen Patienten zumindest teilweise wieder aufgebaut wird. Die Funktion der immunologischen Zellen, die voll funktionsfähig sind, sollte hoffentlich in der Lage sein, die verbleibenden chronisch infizierten Zellen bei diesen Patienten anzugreifen. Ob es uns tatsächlich gelingen wird, HIV vollständig und endgültig aus einem Patienten zu eliminieren, können wir zum jetzigen Zeitpunkt nicht sagen.