Die Anwendung eines C. elegans Dopamin Neuron Degeneration Assay für die Validierung von potenziellen Parkinson Genes

Im Caldwell-Labor, auch bekannt als das Worm Shack, erforschen wir die Mechanismen neurologischer Erkrankungen bei C. elegans. Nach einem langen Tag erfolgreicher Experimente belohnen wir uns mit einer Freizeitbeschäftigung. Hallo, ich bin Adam Knight, Student im Bachelorstudiengang aus dem Caldwell-Labor im Fachbereich Biowissenschaften der University of Alabama.

Heute werde ich gemeinsam mit anderen zeigen, wie man einen Assay zur Dopamin-Neuronen-Degeneration in C. elegans durchführt. Ich werde einen Wurms Stamm mit degenerierenden Dopamin-Neuronen mit transgenen Stämmen kreuzen, die kandidatenbezogene krankheitsrelevante Gene und Dopamin-Neuronen überexprimieren. Hallo, ich bin Adam Harrington, ein Doktorand im Caldwell-Labor.

Heute zeige ich Ihnen, wie man transgene Würmer für die Analyse von Dopaminneuronen vorbereitet. Hallo, ich bin Shu Amichi und ich bin eine Doktorandin. Hier zeige ich Ihnen, wie man die Dopaminneuronen von C. elegans untersucht, die als CEPs und ADEs bezeichnet werden.

Im Allgemeinen zeigen Würmer, die nur GFP in den Dopaminneuronen exprimieren, keinen Zelltod. In Gegenwart von CLE beobachten Sie jedoch eine altersabhängige Neurodegeneration. Mithilfe dieses Assays kann ein Transgen in den Dopaminneuronen gleichzeitig exprimiert werden, um zu bestimmen, ob es die durch CLE induzierte Toxizität verstärken oder unterdrücken kann. Beginnen wir also.

Bevor die Analyse der Dopaminneurone durchgeführt wird, müssen zunächst die geeigneten GaN-Stämme gekreuzt werden, um acht Männchen zu erhalten, die sowohl alphas nucle als auch GFP unter Kontrolle des dopaminergen Neuron-spezifischen Promotors dat-1 exprimieren, indem sie auf eine Begattungsplatte gebracht werden. Fügen Sie nun zwei L4-Stadium-transgene C. elegans-Hermaphroditen hinzu, die eine dopaminerge Neuron-spezifische Expression unseres Kandidatengens von Interesse sowie eine Expression des fluoreszenten selektierbaren Markers DSRed2 in den Körperwandmuskeln zeigen. Es ist wichtig zu beachten, dass für jeden Transgen-Konstrukt drei stabile transgene Linien erzeugt werden.

Daher sollte dieser genetische Kreuzversuch einzeln für jede der drei separaten stabilen Linien durchgeführt werden. Nach zwei Tagen die Männchen entfernen und entsorgen, nach weiteren zwei bis drei Tagen. Die F1-Generation untersuchen.

Es gibt mehrere männliche Nachkommen, und die Kreuzung war erfolgreich. Überführen Sie anschließend einzeln fünf Aphrodite-L4-Tiere von jedem Kreuzungsansatz, die sowohl den GFP-Fluoreszenzmarker, der vom männlichen Elternteil vererbt wurde, als auch den DS-red-2-Fluoreszenzmarker der Körperwandmuskulatur, der vom hamadi-Elternteil stammt, aufweisen, auf neue Platten. Die überführten Tiere müssen sich im L4-Stadium befinden, um sicherzustellen, dass sie noch keine Mitose (M it) durchlaufen haben.

Unter Anwesenheit der männlichen Tiere auf der Platte lassen Sie die Tiere drei bis vier Tage lang zur Selbstbefruchtung zu, um Nachkommen der F2-Generation zu erzeugen. Entfernen Sie nun die F2-Nachkommen, um dies zu erreichen. Übertragen Sie fünf bis 10 Tiere, die beide Markermerkmale aufweisen, jeweils auf separate Einzelplatten.

Dann die F3-Generation auf Platten screenen, bei denen hundert Prozent der Tiere GFP in den Dopaminneuronen exprimieren und bei denen einige der Tiere den fluoreszierenden Marker DS-Red2 in den Muskelzellen der Körperwand exprimieren. Diese Tiere sind homozygot für die Gene des Alpha-Synucleins und des GFP und übertragen außerdem das neu erzeugte Transgen stabil. Sobald der Screening abgeschlossen ist, können wir die Analyse der dopaminergen Neuronen durchführen.

Um die Neuronenanalyse zu beginnen, bereiten Sie eine frische Platte mit den drei im vorherigen Schritt identifizierten F-Tieren vor. Richten Sie für jede der drei transgenen Linien eine separate Platte ein. Zusätzlich sollten Sie die Alpha-Synuclein-GFP-einzelstamm-Platte als Kontrolle ansetzen und die Würmer bis zum Erwachsenenstadium wachsen lassen.

Sobald die Würmer das Erwachsenenstadium erreicht haben, überführen Sie 30 bis 40 transgene Tiere jeder Linie auf eine frische Platte. Lassen Sie sie fünf Stunden lang bei 20 Grad Celsius Eier legen. Entfernen und entsorgen Sie die Tiere nach fünf Stunden.

Die erwachsenen Tiere lassen die Embryonen drei bis vier Tage bei 20 Grad Celsius entwickeln, bis sie das L4-Stadium erreichen. Danach etwa hundert transgene L4-Tiere auf eine Platte mit 0,04 Milligramm pro Milliliter 5-Fluor-2'-deoxyuridin pikieren.

Dieses Nukleotid-Analogon verhindert die Entwicklung der nächsten Generation durch Hemmung der DNA-Synthese. Da die FDUR-Platten lichtempfindlich sind, schützen Sie sie vor Licht, indem Sie die Platten bedeckt halten und vollständig umhüllt aufbewahren. Bereiten Sie einen großen Pad für die Wurmanalyse vor.

Sie werden frisch verwendet und dürfen nicht austrocknen. Legen Sie zwei Objektträger bereit, auf denen jeweils ein Stück Klebeband längs befestigt ist. Das Klebeband dient als Abstandshalter für gleich dicke Polster.

Legen Sie einen dritten Objektträger zwischen sie auf den Arbeitstisch. Sie sind positioniert. Drei nebeneinander.

Geben Sie einen Tropfen geschmolzenes Arus auf die Mittelseite und legen Sie schnell eine weitere Objektträgerplatte senkrecht über die Agros und über alle drei Objektträger. Wiederholen Sie dies, um mehrere zusätzliche Pads herzustellen, je nach Anzahl der zu analysierenden Proben. Sobald die Auger-Pads bereit sind, geben Sie einen sechs Mikroliter großen Tropfen einer dreimillimolaren, 11 Millimolar-Säge- und Anästhetikumlösung auf ein 22 mal 30 Millimeter großes Deckglas.

40 erwachsene Tiere in den Tropfen geben und dann das Deckglas auf das Agarose-Pad umgedreht aufsetzen. Dies für jede der anderen Linien wiederholen. Bei 30 Tieren pro Linie das Vorhandensein jedes CEP und eines D-Neurons bewerten.

Unter Verwendung eines Auflicht-Fluoreszenzmikroskops mit einem Filterwürfel, der die Visualisierung von FITC oder GFP ermöglicht, werden wir mithilfe eines Endo-G-F-P-H-Y-Q-Filterwürfels die Daten auf einem Auswertungsblatt erfassen. Wildtyp-Tiere behalten in allen vier CEP-Neuronen und zwei ADE-Neuronen ein vollständiges GFP-Signal bei. Einzelne Tiere, die einen Verlust des D-Neuronen-Signals aufweisen, werden als bekannter Wildtyp oder als degenerierend eingestuft.

Diese Neuronen werden als LG oder Verlust von GFP erfasst. Ebenso kann das Ausmaß der Degeneration bewertet werden, indem die Gesamtzahl der verlorenen Neuronen in jedem Tier gezählt wird, und die Analyse von der Population noch zweimal wiederholt wird. Unter Verwendung von jeweils 30 weiteren Tieren pro Linie pro Versuch.

Die Gesamtanzahl der Würmer mit Wildtyp-Dopaminneuronen aus den drei Analyserunden wird gemittelt. Die statistische Analyse zur Neuroprotektion wird anschließend mithilfe des Student’schen t-Tests mit einem P-Wert von weniger als 0,05 durchgeführt. Um Kontrollwürmer mit Stämmen zu vergleichen, die Kandidatengene in Dopaminneuronen überexprimieren, wird diese Analyse an verschiedenen Tagen nach der Eiablage durchgeführt, wobei die geeigneten Analysetage empirisch bestimmt werden.

Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass 77 %, 87 % bzw. 90 % der Tiere mit dem Alpha-CLE-Plus-GFP-Transgen degenerierte Dopaminneurone am sechsten, siebten und zehnten Tag nach der Entwicklung aufweisen. Wenn daher erwartet wird, dass das untersuchte Transgen die Neurodegeneration verstärkt, erfolgt die Analyse am sechsten Tag. Entsprechend werden Transgene, die die Neurodegeneration möglicherweise unterdrücken, am siebten und zehnten Tag analysiert.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man einen Dopamin-Neurodegenerationsassay bei C. elegans durchführt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, folgendes zu beachten: Erstens, verwenden Sie einen geeigneten Marker für die Selektion während der genetischen Kreuzungen. Zweitens, verwenden Sie gesunde Männchen und L4-Hermaphroditen für die Kreuzungen.

Und drei, stellen Sie sicher, dass Sie die CEP- und die DE-Neuronen sorgfältig und konsistent bewerten. Dieses Verfahren ermöglicht es Ihnen, schnell genetische Faktoren auf ihre fördernde oder hemmende Wirkung auf die durch alpha alpha CLE induzierte Neurodegeneration zu untersuchen. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.