Screening für Amyloid-Aggregation durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese

Hallo, ich bin Randall Hoffman, ein Doktorand im Labor von Susan Linus in der Biologieabteilung des MIT. Heute werde ich Ihnen die halbdenaturierende Detergens-Agarose-Gelelektrophorese, auch SDD-AGE genannt, vorstellen. Unser Labor nutzt diese Technik, um auf Prionen und andere amyloide Proteine zu screenen.

Unsere Version des SDD-Alters ist einfach und zuverlässig und kann problemlos für jede Anzahl von Proben skaliert werden. Amyloide sind außergewöhnlich resistent gegenüber Denaturierung durch SDS, wodurch sie mithilfe der SDDH von anderen Proteinen getrennt werden können. Allerdings können Daten aus der SDDH allein nicht verwendet werden, um zu bestätigen, dass es sich bei einer Substanz um Amyloid handelt.

Dazu müssen Sie andere Techniken anwenden. Vor diesem Hintergrund möchte ich Ihnen zeigen, wie das geht. S-D-D-H-S-D-D-H kann mit Standardausrüstung für horizontale DNA-Elektrophorese durchgeführt werden.

Zunächst müssen Sie die Gießform für das Gel zusammenbauen. Die Größe der Apparatur hängt davon ab, wie viele Proben Sie haben. Bei einer großen Anzahl von Proben verwenden wir eine 20 mal 24 Zentimeter große Platte und bis zu vier Kämme mit je 50 Vertiefungen.

Um das Gel vorzubereiten, benötigen Sie Agarose mit mittlerer oder hoher Gelfestigkeit und niedrigem EEO-Gehalt, 1× TAE-Puffer und eine 10%-ige Stammlösung von SDS. Stellen Sie eine 1,5%-ige Agaroselösung in 1× TAE her. Sie sollten das Gel so dick wie möglich anfertigen, um die maximale Probenmenge aufzuladen und die Detektion zu optimieren. Erhitzen Sie die Mischung in der Mikrowelle, bis die Agarose vollständig gelöst ist.

Geben Sie den 100fachen XSDS-Stock schnell zu 0,1 % hinzu und schwenken Sie zur Vermischung. Falls sich während dieses Schritts etwas Agarose absetzt, lösen Sie diese auf einem Heizplättchen erneut auf. Achten Sie darauf, dass es nicht kocht.

Nachdem SDS zugegeben wurde, kann die Lösung leicht überlaufen; gießen Sie die Lösung daher noch heiß in das Gießtablett. Verwenden Sie anschließend einen Kamm, um eventuelle Blasen zu entfernen, die später während der Gelelektrophorese stören könnten. Sobald das Gel vollständig abgekühlt und erstarrt ist, nehmen Sie den Kamm vorsichtig heraus und stellen das Gel in den Tank.

Das Gel vollständig in einem XTAE mit 0,1 % SDS untertauchen. Nun können die Proben aufgetragen werden. Die in der SDDH verwendeten Proteinproben werden genauso wie bei einer SDS-Gelelektrophorese vorbereitet, mit zwei wichtigen Ausnahmen.

Zunächst sollten Sie vermeiden, die Proben zu erhitzen, da dies die Aggregate in Proteinmonomere denaturieren könnte. Zweitens ist darauf zu achten, einen Proteinabbau zu vermeiden. Da die hier verwendeten denaturierenden Bedingungen nicht ausreichen, um alle Proteasen zu inaktivieren, empfehlen wir die Verwendung einer Proteaseinhibitor-Cocktail-Lösung in mindestens doppelter empfohlener Konzentration.

In dieser Demonstration verwenden wir Lysate von Hefezellen, die ein bestimmtes Protein von Interesse überexprimieren. Üblicherweise verwenden wir zwei ml Übernachtkulturen, die in 96-Well-Blöcken von VWR gezüchtet wurden. Bei der Analyse von Proteinen mit geringer Abundanz müssen jedoch größere Kulturvolumina verwendet werden.

Die Zellen durch Zentrifugation der Kultur bei 2000 RCF für fünf Minuten bei Raumtemperatur gewinnen; nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und die Zellen durch Resuspendierung in Wasser waschen und erneut zentrifugieren. Nach dem zweiten Zentrifugationsschritt den Überstand entfernen und die Zellen in frischer Plating-Lösung resuspendieren. Die in der Lösung enthaltenen Enzyme verdauen die Zellwände, wodurch eine effiziente Lyse der Zellen mit einem geringen Volumen an Lysepuffer ermöglicht wird. 30 Minuten bei 30 Grad Celsius inkubieren.

Pelletieren Sie diesmal die überschüssigen Plastikzellen bei 800 RCF für fünf Minuten. Entfernen Sie das Überstand vollständig und resuspendieren Sie jedes Pellet in 100 Mikrolitern Lysepuffer. Bedecken Sie anschließend den Block mit Klebeband und führen Sie eine Vortex-Behandlung bei hoher Geschwindigkeit für zwei Minuten durch.

Dadurch wird ermöglicht, dass alle sphärischen Kunststoffe LY P sind, um die zellulären Trümmer bei 4.000 RCF für zwei Minuten abzuzentrifugieren. Überführen Sie das S natin vorsichtig in eine 96-Well-PCR-Platte.

Typischerweise analysieren wir in unserem Labor gleichzeitig Hunderte von Proben, weshalb wir ein Flüssigkeitsmanagementsystem verwenden. Falls gewünscht, bestimmen Sie die Protein-Konzentration der Lysate. Fügen Sie anschließend vierfach Puffer auf Probenbasis zu den Proben hinzu, um Lysate zu erzeugen, die einfachen Puffer auf Probenbasis enthalten, und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Jetzt die Proben auf das Gel auftragen. Falls gewünscht, die Hälfte der Proben für die SDS-Page-Analyse aufbewahren. Außerdem molekulare Gewichtsmarker laden, einschließlich vorgefärbter Marker und eines Markers mit sehr hohem molekularem Gewicht, wie beispielsweise Hühnermuskelextrakt.

Falls gewünscht, ist es wichtig, das Gel kühl zu halten, um eine Diffusion von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht zu verhindern; daher kann es sinnvoll sein, es im Kühlschrank laufen zu lassen. Führen Sie das Gel bei niedriger Spannung, weniger als drei Volt pro Zentimeter Gellänge, durch. Laufen Sie das Gel mehrere Stunden lang, bis sich das Diare etwa einen Zentimeter vom Ende des Gels entfernt hat.

Da Amyloid bei Raumtemperatur nicht durch 2 % SDS denaturiert wird, bleibt es intakt, während andere Komplexe, einschließlich der meisten nicht-amyloiden Aggregate, in Gegenwart von 2 % SDS dissoziieren. Daher werden die meisten Proteine monomer sein und schnell durch das Gel wandern, während die SDS-resistenten Amyloide mit hohem Molekulargewicht langsamer wandern.

Danach ist das Gel für die Übertragung bereit. Obwohl mehrere Übertragungsmethoden verwendet werden können, erzielen wir die besten Ergebnisse mit der kapillaren Übertragung. Da die kapillare Übertragung Gels jeder Größe verarbeiten kann, ist es praktisch, Hunderte von Proben mittels kapillarer Übertragung zu analysieren.

Ein Stapel trockener Abblott-Papiere dient dazu, Puffer durch das Gel zu ziehen, wodurch Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen werden, die zwischen den Papieren und dem Gel platziert ist. Sie müssen ein Stück Nitrocellulose, beispielsweise High Bond C, zusätzlich in denselben Abmessungen wie das Gel zuschneiden. Außerdem müssen Sie 20 Stück GBO oh vier und acht Stück GBO oh zwei Abblott-Papier auf die gleiche Größe wie das Gel zuschneiden.

GB oh vier ist sehr dick und saugfähig. GBO oh zwei hingegen ist viel dünner und hat eine feinere Textur, wodurch ein gleichmäßigerer Kontakt mit der Membran gewährleistet wird. Schneiden Sie ein zusätzliches Stück GBO oh vier als Docht zu und machen Sie es etwa 20 Zentimeter breiter als das eingetauchte Gel.

Der nitrous UL WIC und vier Stücke GBO oh zwei und ein XTBS in einem Plastikbehälter setzen einen Stapel Papier wie folgt zusammen: 20 Stück trockenes GBO oh vier. Dann vier Stück trockenes GBO oh zwei. Dann ein Stück vorbefeuchtetes GBO oh zwei.

Legen Sie die Nitrocellulose auf diesen Stapel. Spülen Sie das Gel auf dem Gießträger kurz mit Wasser, um überschüssiges Laufpuffer zu entfernen. Beginnen Sie dann vorsichtig, das Gel vom Träger auf den Stapel zu schieben, und benetzen Sie das Gel beim Herausschieben vom Träger bei Bedarf mit TBS.

Das zusätzliche Puffer hilft dabei, zu verhindern, dass Blasen im Gel eingeschlossen werden. Die Transferpipette eignet sich gut für diesen Zweck, nachdem das Gel vollständig auf den Stapel übertragen wurde. Überprüfen Sie gründlich auf Blasen, falls vorhanden.

Heben Sie den Rand des Gels an und geben Sie erneut Puffer hinzu, bis die Blasen herausgedrückt sind. Legen Sie die restlichen drei vorbenetzten GBO-ohne-zwei-Stücke auf das Gel. Stellen Sie einen vollständigen Kontakt zwischen allen Schichten her, indem Sie eine Pipette fest über den Stapel rollen.

Platzieren Sie zwei erhöhte Behälter mit TBS, die die Transferanordnung flankieren, und legen Sie den vorbenetzten Docht so über den Stapel, dass beide Enden des Dochtes untergetaucht sind. Decken Sie den zusammengesetzten Transferstapel in TBS mit einem zusätzlichen Plastikbehälter ab, der zusätzliches Gewicht trägt, beispielsweise eine 500-ml-Wasserflasche. Der Docht saugt Puffer aus den Behältern, und das trockene Blottingpapier zieht den Puffer im Laufe mehrerer Stunden durch das Gel.

Dadurch werden die Proteine auf die Membran aufgetragen; der Transfer sollte mindestens drei Stunden lang oder über Nacht fortgesetzt werden. Nach Abschluss des kapillaren Transfers kann die Membran mit einer Standard-Western-Blot-Analyse weiterverarbeitet werden. Hier sehen Sie einen typischen Blot von Proteinen, die in einem Hefestamm überexprimiert wurden und bestimmte Proteine zur Bildung von Amyloid neigen lassen.

Sie können deutlich erkennen, dass einige unserer Kandidaten Amyloid- oder hochmolekulare, SDS-resistente Spezies sehr gut bilden, wie hier und hier gezeigt. Andere hingegen bilden keine Aggregate und sind vollständig monomer, wie beispielsweise diese und diese. Zusätzlich sehen Sie, dass die Größe der Amyloid-Polymere je nach Protein variiert, was Sie in diesen beiden Bahnen erkennen können.

Wir haben Ihnen soeben eine einfache Methode zur Analyse von hochmolekularen, unlöslichen Aggregaten, wie Amyloiden von potenziellen Prionen, gezeigt. Wir hoffen, dass Ihnen unsere Präsentation gefallen hat und dass Sie diese Technik als nützlich für Untersuchungen amyloider immunogener Proteine erachten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrer Forschung.