Protokolle für Mikroapplikator-assisted Infektion Schmetterlingslarven mit Baculovirus

Während das arthropodenspezifische Baccala-Virus als Standard-Forschungswerkzeug für eukaryotische Proteinexpressionssysteme verwendet wird, wird es auch als umweltverträgliches insektizides Mittel entwickelt, das pflanzenfressende Insekten wie Lepidoptera in der Natur abtöten kann. Lepidopterenlarven werden infiziert, wenn sie infizierte Pflanzenteile fressen. Die Larven oder Raupen nehmen das Baccala-Virus in einer Form auf, die als Polyeder bekannt ist, einem Komplex aus Viruspartikeln, die in einer großen kristallinen Proteinstruktur verpackt sind, die das Virus vor Austrocknung schützt.

Nach der Infektion der Larve verbreitet sich das Virus innerhalb des Insekts. Das Virus übernimmt die Maschinerie des Wirts zur Synthese von Nukleinsäuren und Proteinen, um weitere Viren und Polyederkörperchen zu produzieren. Schließlich ist die Larve derart gründlich mit Viren infiziert, dass sie zu einem zähen Sekret aus Polyederkörperchen zerfällt, das auf Pflanzenteile tropft, die vom Insekt gefressen werden. Dadurch beginnt der Zyklus erneut, um die insektizide Wirksamkeit eines bestimmten Baca zu bestimmen.

Techniken mit Mikroapplikatoren für Avir-Stämme und Bioassays können kombiniert werden. Larven können durch Injektion von Viruspartikeln direkt in die Hämolymphe oder Körperhöhle infiziert werden, woraufhin die Sterblichkeitsraten bewertet werden können. Zusätzlich können Larven mittels oraler Mikroapplikation mit Polyedern infiziert werden, und der Zeitpunkt der Infektion des Darms sowie anderer Gewebe kann analysiert werden.

Hi, ich bin Wendy Sparks im Labor von Brian e boning an der Abteilung für Entomologie an der Iowa State University, und ich komme ebenfalls von boning snap. Heute zeigen wir Ihnen zwei Verfahren zur Infektion von Labordrosseln mit dem Backlog-Virus. Beide Methoden verwenden einen Mikroapplikator.

Zunächst zeige ich Ihnen, wie man einen Mikroapplikator verwendet, um Körpervirus über die Prole in das He in das Heni einzubringen. Anschließend zeige ich Ihnen, wie man den Mikroapplikator verwendet, um Poly-Header über die Maus in die Mittelsperre einzuführen. Beginnen wir also.

Wenn Balo-Viren für insektizide Zwecke entwickelt werden, enthalten sie gewöhnlich das Polyhedrin-Gen, um die orale Infektion von Schadinsektenlarven zu erleichtern. Gelegentlich gibt es jedoch Gründe, ein polyhedron-negatives Baculovirus auf mögliche insektizide Wirkungen zu testen oder den Darm eines Insekts zu umgehen. In diesem Fall kann eine Injektion des freien Virus mit einem Mikroapplikator durchgeführt werden, um die Larven vor Beginn des Assays zu infizieren.

Die Titer der Arbeitsprobe des butted Virus sollten mittels Plaque-Assay oder Endpunktverdünnungsassays bestimmt werden. Für physiologische Experimente wären Injektionen von fünf mal 10 hoch vier PFU pro fünfter Instar H VNS typisch. Um diesen Bioassay zu beginnen, füllen Sie jede Verdünnung des butted Virus in eine plastische Ein-Kubikzentimeter-Hercule-Spritze mit einer 28,5- oder 32-Gauge-Spitze.

Normalerweise ein bis drei Mikroliter der angespitzten Viruslösung mit einer Titerkonzentration von 10 hoch 7 bis 10 hoch 8 pro Milliliter, die für jede Larve verwendet werden kann, sodass das Befüllen von 300 bis 500 Mikrolitern in die Spritze für die meisten Zwecke ausreicht. Danach werden Luftblasen aus der Spritze entfernt, indem man die Spritze aufrecht hält, um die Luft an die Nadelspitze zu bringen, und dann etwas Flüssigkeit abgibt.

Befestigen Sie dann die Spritze an der Spritzenhalterung. Stellen Sie nun das Volumen auf 1,0 Mikroliter ein. Kalibrieren Sie für jeden Tropfen an der Mikroprozessor-Steuerungseinheit des Mikroapplikators zunächst die Steuerungseinheit, um sicherzustellen, dass das korrekte Volumen abgegeben wird. Die Geschwindigkeit, mit der der Tropfen abgegeben wird, kann auf einer Skala von null bis neun eingestellt werden.

Ein Bereich von null bis eins wird üblicherweise verwendet. Drücken Sie den Fußschalter, um sicherzustellen, dass die Lösung angemessen abgegeben wird. Beachten Sie, dass bei zu großer abgegebener Menge oder zu langsamer Applikation die Volumen- und Geschwindigkeitseinstellungen so lange angepasst werden können, bis das richtige Lösungsvolumen mit der korrekten Rate appliziert wird.

Ich bin nun bereit, die Injektion für die HVNS-Infektion durchzuführen. Frühe Larven im fünften Stadium werden typischerweise injiziert, da die größere Größe der späteren Larvenstadien den Injektionsvorgang erleichtert. Führen Sie die Nadelspitze durch die Plana eines der Vorderbeine und in die Körperhöhle ein.

Beachten Sie, dass beim Einführen der Nadelspitze in das Prole die Position des Larvenkörpers verändert werden muss, um den Darm und die Körperwand nicht zu beschädigen. Drücken Sie nun viermal den Fußschalter, um vier Mikroliter der Viruslösung in die Hämolymphe abzugeben. Nach Abschluss der Injektionen bringen Sie alle Larven in den Inkubator bei 28 Grad Celsius zurück. Überprüfen Sie regelmäßig auf tote Larven und stellen Sie sicher, dass ausreichend Nahrung für die überlebenden Larven verfügbar ist.

Auch wenn späte Larvenstadien nicht an Verletzungen des Cuticula durch Injektion sterben, sollten die Larven dennoch 24 Stunden nach der Injektion überprüft werden, um Schäden am Darm auszuschließen, die durch bakterielle Infektionen verursacht sein könnten. Diese frühe Mortalität sollte von der Datenanalyse ausgeschlossen werden. Wenn der mikroapplikatorgestützte Bioassay mit abgeschnittenem Virus für letale Konzentrationsbestimmungen verwendet wird, sollte der Bioassay an getrennten Termin drei- oder viermal wiederholt werden.

Verwenden Sie 30 Individuen pro Dosis für jeden Virus oder jede Kontrollbehandlung. Nutzen Sie ein geeignetes Programm zur Probit-Analyse, wie zum Beispiel Polo oder SAS, um die LC50-Werte, 95-%-Konfidenzintervalle und die entsprechenden statistischen Kenngrößen zu berechnen. Dieser Bioassay kann ebenfalls verwendet werden, um ST50-Überlebenszeitwerte nach Inokulation einer festen Virusdosis zu bestimmen.

In diesem Fall wird die Larvenmortalität alle vier bis acht Stunden mit häufigeren Beobachtungen erfasst. Wenn die Mortalitätsrate hoch ist, werden die medianen Überlebenszeiten innerhalb der 95-%-Konfidenzintervalle unter Verwendung des Kaplan-Meier-Schätzers mit einem S-Plus- oder SAS-Programm berechnet. Nun, da Harran Ihnen den mikroapplikatorgestützten Bioassay unter Verwendung von butted Virus gezeigt hat.

Ich zeige Ihnen den Assay. Die orale Applikation von Polyedern direkt in den Insekten-Darm wird angewendet, wenn der exakte Zeitpunkt der Infektion entscheidend ist. Zum Beispiel, wenn man untersucht, wie sich das Virus innerhalb des Insekts ausbreitet, suspendieren Sie zu Beginn des Assays die Polyeder in einer neutral schwimmenden Lösung aus drei Teilen Glycerin und zwei Teilen Wasser von 10 bis 300.

Polyeder könnten beispielsweise für die vierte Larvenstadiums-Infektion verwendet werden. Danach diese Lösung in eine plastische oder gläserne Ein-Kubikzentimeter-Tuberkulinspritze mit einer stumpfen Nadel der Größe 32 laden. Die Spritze auf das Halterungsrohr des Mikroapplikators setzen und durch ein Mikroskop schauen.

Halten Sie die vierte oder fünfte Instar-Larve, führen Sie die Nadel durch den Mund in den vorderen Bereich des Mitteldarms ein und geben Sie anschließend die Polyeder ab. Diese Technik erfordert etwas Übung. Zunächst kann es schwierig sein, die Larven mit Handschuhen zu halten, ohne sie zu zerdrücken.

Zweitens bedarf es etwas Übung, um die Nadel an den Mundteilen vorbeizuführen. Wir empfehlen, dass Sie das Inokulieren von etwa 30 Larven mit PBS üben. Sollten Sie versehentlich den Darm durchstechen, wird dies offensichtlich sein, da die Larven dann melanisieren und sich recht schnell schwarz färben.

Auch hier ist die orale Inokulation mithilfe eines Mikroapplikators besonders nützlich für Experimente, bei denen der Infektionszeitpunkt wichtig ist, um die Ausbreitung des Virus innerhalb des Insekts zu untersuchen, da dieser exakt bestimmt werden kann. Beispielsweise können Viren, die Beta-Galactosidase exprimieren, oral in Larven inokuliert werden, die anschließend zu verschiedenen Zeitpunkten seziert werden, um festzustellen, welche Gewebe zu welchem Zeitpunkt infiziert werden. Wir zeigen Ihnen lediglich zwei mit dem Mikroapplikator durchgeführte Infektionsverfahren. Insekten werden mit Virus infiziert, wobei die erste Methode die direkte Inokulation über das Pro-Bein mit abgeschwächtem Virus ist, wodurch die Physiologie des Darms umgangen wird und Sie so die Letalität und die letale Zeit des untersuchten Virus beurteilen können.

Die zweite Technik war die direkte Inokulation in den Mitteldarm unter Verwendung von Polyedern. Dadurch können Sie eine sehr präzise Dosis direkt in den Mitteldarm verabreichen und zudem den exakten Zeitpunkt des Ereignisses kontrollieren. Anschließend können Sie auch die Mortalität und andere Phänotypen des Virus untersuchen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die von dem Baula-Virus getöteten Larven in der Regel zerbrechlich sind und leicht platzen können, wodurch das Virus freigesetzt wird. Deshalb müssen Arbeitsflächen sterilisiert und kontaminierte Handschuhe sowie Einwegmaterialien angemessen entsorgt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg mit Ihrem Experiment.