Reaggregieren Thymus Kulturen

Hallo, ich bin Andrea White aus dem Labor von Graham Anderson und Eric Jenkinson am MRC-Zentrum für Immunregulation der Universität Birmingham. Heute stelle ich eine Anleitung zur Herstellung von reaggregierten thymischen Organkulturen vor, die zur Untersuchung komplexer zellulärer Interaktionen während der T-Zell-Differenzierung verwendet werden können. Vor Beginn dieses Verfahrens wurden embryonale Thymuslappen isoliert und behandelt, um alle Lymphozyten zu entfernen.

Dies ist in einem separaten Video zu sehen. Die Alienoid-Lappen werden anschließend disaggregiert, um eine stromale Zellpräparation herzustellen. Schließlich werden die Zellen zu einer reaggregierten fmic-Organkultur zusammengefasst.

Beginnen wir. Nach fünf bis sieben Tagen in Kultur sollten die LOs bereit sein, für die Herstellung von Schwarmzellenpräparationen disaggregiert zu werden. Tauchen Sie die 0,8-Mikrometer-Filter in eine Petrischale mit RPMI 1640 plus 10 % FCS. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig alle Faserhange ab, die nicht von alleine abgehen. Verwenden Sie eine 1-mL-Pipette, um die Lappen in ein 1,5-mL-Eppendorf-Röhrchen zu überführen.

Wir empfehlen nicht mehr als 50 Lappen pro Eppendorf-Röhrchen. Lassen Sie die Lappen durch Einheitsgravitation auf den Boden des Röhrchens sedimentieren und entfernen Sie das Medium. Waschen Sie die Lappen mit einem Milliliter PBS und lassen Sie die Lappen anschließend erneut auf den Boden absinken.

Wiederholen Sie dies insgesamt dreimal mit PBS-Spülungen, entfernen Sie die letzte PBS-Spülung und geben Sie 600 Mikroliter einer 0,25 %igen Trips-Lösung hinzu. Stellen Sie das Eppendorf-Röhrchen 25 Minuten lang in einen 37-Grad-Inkubator. Pipettieren Sie die Lappen vorsichtig mit einer 1-mL-blauen Spitze an einem Pipettiergerät für 10 Sekunden und stellen Sie sie danach erneut 20 Minuten lang in den Inkubator. Anschließend pipettieren Sie die Lappen mehrmals auf und ab, um sie vollständig zu dispergieren.

Es sollte ungefähr 30 Sekunden dauern. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, geben Sie 400 Mikroliter eiskaltes RPMI 1640 plus 10 % FCS hinzu, um die Trypsinaktivität zu neutralisieren, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei tausend U/min, 10 Minuten bei vier Grad C, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter RPMI 1640 plus 10 % FCS, falls gewünscht. Zählen Sie die Zellen.

Typischerweise würden wir ausgehend von einem E15-fibrösen Gewebe etwa 50.000 Zellen pro Dioxazin-Lappen erwarten. Nun sind wir bereit, die Aggregatkulturen von fmic-Corgan in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen zu bilden. Gemischt, frisch präparierte feine stromale Zellen.

Zusammen mit vorabselektierten CD4-positiven CD8-positiven Fibrozyten. Wir empfehlen ein Verhältnis von etwa 1:1 zwischen Stromazellen und Fibrozyten. Die Anzahl der Zellen, die Sie verwenden werden, hängt von der verfügbaren Zellzahl und den durchzuführenden Experimenten ab.

Wir empfehlen insgesamt mindestens hunderttausend Zellen und nicht mehr als 1,5 Millionen Zellen. Die V-Aggregate sollten groß genug sein, um reproduzierbar zu sein, aber nicht so groß, dass das Zentrum abstirbt. Pelleten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei eintausend U/min für 10 Minuten. Bei vier Grad Celsius setzen Sie den Organkulturfilter sorgfältig zusammen.

Entfernen Sie vollständig das a SUP natin im Stadium mit einem P 200 pro Petrischale. Vortexen Sie das Zellpellet 10 Sekunden lang, um eine Suspension zu bilden. Das Volumen sollte etwa ein bis zwei Mikroliter betragen.

Befördern Sie die Suspension mit einem fein gezogenen Pipettenspitzenende auf den Filter, wobei die Zellsuspension an der Spitze der Pipette gehalten wird. Unter dem Stereomikroskop bringen Sie die Zellsuspension vorsichtig mundpipettierend in die Mitte eines 0,8-Mikrometer-Filters auf. Idealweise sollten die Zellen als stehender Tropfen in einem Kreis mit einem Durchmesser von ein bis zwei Millimetern aufgebracht werden.

Wenn die Suspension anfängt, sich auszubreiten, lassen Sie die Flüssigkeit in der Suspension durch das Pos ablaufen, bevor Sie die verbleibenden Zellen absetzen. Stellen Sie die Schale in eine Kunststoff-Sandwichbox und verschließen Sie sie. Wie bei Thymus-Organkulturen aggregieren sich die Kulturen innerhalb von 18 Stunden nach der Kultivierung zu intakten Strukturen, und stellen Sie eine Box in einen Inkubator.

Nach vier bis fünf Tagen der Kultur bilden sie sowohl reife Zellsubpopulationen mit CD4-positiv/CD8-negativ als auch CD4-negativ/CD8-positiv aus. Der Ansatz mit 50 mit Dioxazin behandelten Lappen sollte ausreichend Stromazellen liefern, um drei bis fünf Reaggregatkulturen anzulegen. Diese Kulturen erscheinen typischerweise als zusammenhängende Zellhaufen, die mithilfe einer Pinzette problemlos von den Filtern abgelöst werden können, ohne sie zu beschädigen.

Wir haben soeben die Methode beschrieben, mit der die positive Selektion durch F-Epithelzellen untersucht werden kann. Diese Methode kann ebenfalls zur Untersuchung der dendritischen Zell-vermittelten negativen Selektion verwendet werden. Schließlich, durch Verwendung von TCR-transgenen FIBROZYTEN oder MHC-Klasse-eins-defizienten bzw. MHC-Klasse-zwei-defizienten Stromazellen.

Dieses System ermöglicht getrennte Untersuchungen der Selektion von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Zellen. Vielen Dank fürs Zuschauen.