Neuronale Kerne Isolation von Human Postmortem Gehirngewebe

Um die Chromatin-DNA-Interaktionen zu untersuchen, die die neuronenspezifische Genexpression im menschlichen Gehirn steuern, muss zunächst eine reine Population neuronaler Kerne gewonnen werden. Postmortales menschliches Hirngewebe wird homogenisiert und die gesamten Kerne mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Anschließend werden die Kerne mit neuronenspezifischen Antikörpern markiert, die über die Flusszytometrie sortiert werden, und abschließend durch Ultrazentrifugation angereichert.

Hallo, ich bin Anish Matan aus dem Labor von Dr. Sharon mc Barian hier in der Abteilung für Psychiatrie der University of Massachusetts Medical School. Heute zeige ich Ihnen ein Verfahren zur Isolierung neuronaler Kerne aus postmortalen menschlichen Hirngeweben. Beginnen wir also.

Für jede zu sortierende Kernprobe beginnen Sie mit tausend Milligramm gefrorenem postmortalen Hirngewebe. Mit dieser Menge können Sie nach der fluoreszenzaktivierten Sortierung etwa 5 Millionen neuronale Kerne erhalten. Um die Kernextraktion zu beginnen, geben Sie 250 Milligramm Hirngewebe in einen Douncer, der fünf Milliliter Lysepuffer enthält, und stellen Sie ihn auf Eis.

Nachdem das Gewebe aufgetaut ist, kühlen Sie es eine Minute lang auf Eis ab. Nach dem Abkühlen überführen Sie das homogenisierte Gewebe in eine klare 15-ml-Ultrazentrifugenrobe und stellen dann das Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie diese Homogenisierung für das verbleibende Gewebe.

Als Nächstes pipettieren Sie vorsichtig neun Milliliter Saccharoselösung auf den Boden der Ultrazentrifugenröhrchen, um einen Konzentrationsgradienten einzurichten, sodass die homogenisierte Gewebelösung über der Saccharoselösung liegt. Wiegen Sie nun die Ultrazentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, dass sie während der Ultrazentrifugation ausbalanciert sind. Nehmen Sie Gewichtsanpassungen vor, indem Sie Lysepuffer zur oberen Schicht hinzufügen. Nachdem die Röhrchen gewogen wurden, stellen Sie sie unter Verwendung des SW-28-Rotors in die Ultrazentrifuge und zentrifugieren die Proben bei 107163,6 × g für 2,5 Stunden bei vier Grad Celsius.

Nach Beendigung der Zentrifugation wird der Überstand sowie die Schicht aus Trübstoffen an der Konzentrationsgradienten entfernt. Achten Sie darauf, das Pellet am Boden des Gefäßes, das die Kerne enthält, nicht aufzuwirbeln. Geben Sie anschließend 500 µL 1× PBS zu jedem Pellet hinzu und lassen Sie die Probe 20 Minuten auf Eis stehen.

Nach 20 Minuten resuspendieren Sie die Pellets durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Die Inkubation auf Eis ermöglicht es, dass sich die Pellets leicht von selbst auflösen, wodurch das Resuspendieren der Kerne erleichtert wird und somit die mechanische Belastung der Kerne verringert wird. Danach übertragen Sie die resuspendierte Probe und die Kerne auf zwei Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Kombinieren Sie die Nukleinsäurelösung aus zwei der Ultrazentrifugenröhrchen in je einem Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie die Proben erneut auf Eis. Da die Nukleinsäure-Extraktion nun abgeschlossen ist, werde ich nun mit dem Immunfärbungsschritt fortfahren, um neuronale Kerne mittels FACS zu isolieren. Die Probe, die Kerne enthält, wird mit einer Immunfärbemischung inkubiert, die aus primären und sekundären Antikörpern sowie Blockierlösung besteht. Um die Immunfärbemischung herzustellen, geben Sie 1,2 µL neuronenspezifischen Antikörper (NeuN) zu 300 µL 1x PBS. Anschließend fügen Sie 100 µL Blockierlösung hinzu, die 0,5 % BSA und 10 % normales Ziegenserum in 1x PBS enthält.

Fügen Sie abschließend ein Mikroliter des sekundären Antikörpers namens LOR 4 88 hinzu. Bereiten Sie außerdem eine Immunfärbung für eine negative Kontrollprobe mit dieser Immunfärbungsmischung vor. Lassen Sie den primären Antikörper new end weg und ersetzen Sie ihn durch 1,2 Mikroliter 1× PBS.

Nun die Immunfärbungsgemische vortexen und fünf Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Während die Färbungsgemische inkubieren, bereiten Sie die Kontrollkernproben für die negative Kontrolle vor, indem Sie 20 Mikroliter der resuspendierten Kerne in ein 2-ml-Gefäß mit 980 Mikrolitern 1× PBS geben. Bereiten Sie außerdem eine unbehandelte Kontrolle vor, die nur die Kernlösung und PBS enthält.

Pipettieren Sie nun 20 Mikroliter der Kerne in ein anderes Röhrchen und stellen Sie das Volumen mit 1× PBS wieder auf ein Milliliter ein. Anschließend alle Proben erneut auf Eis stellen. Inzwischen sind die Immunfärbemischungen fertig.

Inkubieren Sie, indem Sie 401 Mikroliter der Mischung in die entsprechende Probe geben. Die Kernprobe erhielt die Mischung, die sowohl neu als auch LOR 4 88 enthält. Die negative Kontrollprobe erhielt eine Mischung, die nur den sekundären Antikörper LOR 4 88 enthält, während der unbehandelten Kontrollprobe kein Immunschmarker hinzugefügt wurde.

Als Nächstes überführen Sie die Proben in den Coldron und rotieren sie 45 Minuten im Dunkeln. Da die 45-minütige Inkubation nun abgeschlossen ist, werde ich die Proben zur Flow-Zytometrie-Infrastruktureinrichtung der University of Massachusetts Medical School bringen, um eine fluoreszenzaktivierte Sortierung durchzuführen. Während des Transports zur Infrastruktureinrichtung sollten die Proben auf Eis und im Dunkeln gehalten werden. In der Flow-Zytometrie-Infrastruktureinrichtung werden die Proben zunächst durch einen 40-Mikron-Filter filtriert und anschließend einige Minuten lang kalt durch das Gerät geleitet.

Dies geschieht, um vor der Sortierung einige vorläufige Daten zu erhalten. Die unbehandelte Kontrolle bestimmt das Ausmaß der negativen Fluoreszenz. Basierend auf diesen Informationen stellen Sie die Empfindlichkeit des Geräts gegenüber Fluoreszenz ein.

Die gefärbte Kontrolle dient der Kontrolle der Fluoreszenz. Jegliches Hintergrundrauschen aufgrund von Autofluoreszenz legt zu diesem Zeitpunkt die erforderlichen Tore fest, die für die Sortierung benötigt werden. Verschiedene Tore werden zur Sortierung der Proben verwendet.

Hier sind einige typische Daten für das erste Tor. Dieses FACS-Analyse-Diagramm zeigt eine repräsentative Probe nach der Einstellung des Tores. Das erste Tor erkennt Muster von Trümmern und lebensfähigen Zellkernen basierend auf einer Kombination von Einstellungen wie Fluoreszenz und allgemeiner visueller Erfahrung.

Die x-Achse stellt den Vorwärtsstreulichtsignal dar, das der relativen Größe entspricht, während die Y-Achse den Seitenstreulichtsignal darstellt, der für die innere Komplexität wie Granularität steht. Das erste Tor kann ebenfalls einen Hinweis auf die Größe der verschiedenen Kerne in unserer Probe geben. Dies ermöglicht es, Trümmer von den eigentlichen Kernen zu trennen, und hier sind einige typische Daten aus dem zweiten Tor.

Diese Fax-Tabelle zeigt ein Beispiel eines zweiten Gates, das es ermöglicht, Kerne einzeln zu sortieren, während Aggregate aussortiert werden. Dieses Gate analysiert Unterschiede in der Zeitdauer, die Kerne benötigen, um durch den Laser zu gelangen. Aggregate benötigen normalerweise eine längere Zeit für den Durchgang.

Dieser spezifische Parameter ist sehr wichtig, da die Anwesenheit von Aggregaten die Reinheit beeinträchtigen kann, da einige fluoreszierende Nukleotide an nicht fluoreszierende gebunden sein könnten. Schließlich folgen typische Daten aus dem dritten Tor. Dieses Tor ist auf eine spezifische Fluoreszenzwellenlänge eingestellt, die derjenigen des Fluorons in unserem sekundären Antikörper entspricht.

In diesem FACS-Diagramm sehen Sie die Fluoreszenzintensität entlang der X-Achse und einen tiefroten Kanaldetektor, PE-Cy7, entlang der Y-Achse. Diese Punktediagramme ermöglichen eine bessere visuelle Darstellung im Vergleich zu einem einkanaligen Histogramm. Die Verwendung von SCADA erlaubt es, neu generierte positive neuronale Kerne von neu generierten negativen nicht-neuronalen Kernen zu sortieren und zu trennen.

Nachdem alle Gates ausgewählt wurden, werden die Kerne in ein einzelnes XPBS sortiert. Sobald die gesamte Probe den FACS-Sortiervorgang durchlaufen hat, überprüfen Sie die Reinheit der Sortierung, indem Sie eine Eloqua-Analyse der sortierten Probe am Gerät durchführen. Hier sehen Sie ein Beispiel für ein optimales Ergebnis.

Vergleichen Sie hier die Vorabprobe, die eine gemischte Population von Kernen enthält, mit der sortierten Eloqua-Probe, bei der die meisten negativen Kerne entfernt wurden. Beachten Sie, dass die Reinheitsprozentsätze auf der Anzahl der Ereignisse basieren, die die Probe basierend auf den gesetzten Toren kontaminieren. Berücksichtigen Sie, dass beim ersten Durchlauf der Probe durch das Gerät eine gewisse Bleiche auftreten kann, wodurch eine Abschwächung der Signalintensität verursacht wird. Um dies zu berücksichtigen, müssen möglicherweise einige Anpassungen vorgenommen werden.

Nachdem die Probe sortiert wurde, beginnen Sie mit der Aufarbeitung der Zellkerne. Nehmen Sie hierzu 10 ml der sortierten Probe und geben Sie 2 ml Sucroselösung, 50 µL einer einmolarigen Calciumchloridlösung und 30 µL einer einmolarigen Magnesiumacetatlösung hinzu. Falls weniger als 10 ml sortierte Probe vorhanden sind, erhöhen Sie das Volumen durch Zugabe von 1× PBS auf 10 ml oder passen Sie die Zusätze entsprechend an.

Danach die Probe mehrmals umkehren und 15 Minuten auf Eis stellen. Nach 15 Minuten die Probe in einem Schwingkorbrotor bei 1.786 RCF 15 Minuten lang bei vier Grad zentrifugieren. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand abpipettieren, ohne den weißen Pellet am Boden des Röhrchens zu stören.

Lösen Sie das Pellet anschließend in 200 Mikrolitern der geeigneten Lösung auf, die für die vorangegangenen Experimente benötigt wird. In diesem Fall lösen wir das Pellet in Abwärtspuffer für ein nachfolgendes Chip-Experiment auf. Resuspendieren Sie das Pellet dann durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren.

An diesem Punkt können Sie die Kerne in ein kleineres Röhrchen überführen und es in einen minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank stellen. Bis zur weiteren Verwendung. Nun, ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man neuronale Kerne aus menschlichem postmortalen Hirngewebe isoliert. Mit diesen Kernen können Sie eine Reihe unterschiedlicher Analysen durchführen, wie beispielsweise die Chromatin-Immunpräzipitation.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets daran zu denken, die Proben auf Eis zu halten, da die Kerne nicht fixiert sind und bei höherer Temperatur abgebaut werden können. Außerdem ist es wichtig, menschliches Gewebe gemäß den Sicherheitsstufen zwei oder höher im Biosicherheitslabor zu handhaben. Das war's.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.