Methylierte DNA Immunpräzipitation

Dieses Video demonstriert ein Protokoll für die immunpräzipitierte methylierte DNA oder Meetup. Eine Methode, die verwendet wird, um methylierte DNA spezifisch und unvoreingenommen zu isolieren. Die DNA-Methylierung bei Säugetieren zeichnet sich durch die Anlagerung einer Methylgruppe an die C5-Position von Cytosin aus.

Wenn es in einem CPG-Dinukleotid vorhanden ist, handelt es sich um eine reversible epigenetische Markierung, die eine wichtige Rolle in der normalen Entwicklung sowie bei mehreren Krankheitsprozessen spielt. Zu den normalen Funktionen der DNA-Methylierung gehören die Inaktivierung des X-Chromosoms bei Frauen, die Stilllegung repetitiver Elemente, das genomische Imprinting und die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. Es wurde außerdem gezeigt, dass die DNA-Methylierung bei zahlreichen Erkrankungen wie Krebs, Prader-Willi-Syndrom, ICF-Syndrom und Immunschwäche, zentromerischer Instabilität und Gesichtsanomalie-Syndrom eine Rolle spielt.

Bei Krebserkrankungen kann beispielsweise eine abnormale Hypermethylierung von Promotoren zur Stilllegung wichtiger Tumorsuppressorgene führen. Während eine fehlerhafte Hypomethylierung zu chromosomaler Instabilität und Aktivierung von Onkogenen führt, wird der Nachweis durch erstmaliges Beschallen der DNA in Fragmente mit einer Größe von 300 bis 1000 Basenpaaren erreicht. Die beschallte DNA wird anschließend bei 95 Grad Celsius denaturiert.

Primäre Antikörper, die Fünf-Prim-Methazin erkennen, werden hinzugefügt und zur Bindung an methylierte DNA-Fragmente zugelassen. Sekundäre Antikörper, konjugiert an magnetische Dyna-Beads, werden verwendet, um DNA-Fragmente zu isolieren, die durch den primären Antikörper gebunden wurden. Unmethylierte Fragmente werden entfernt und die Antikörper durch Proteinase verdaut.

Die KA-Phenol-Chloroform-Reinigung entfernt das verdauten Protein, und die Präzipitation reinigt die DNA, die nun angereichert ist für methylierte Fragmente. Danach kann die DNA für Anwendungen wie PCR, Mikroarray und Sequenzierung verwendet werden. Das Verfahren wird üblicherweise als zweitägige Prozedur durchgeführt.

Tag eins umfasst die DNA-Präparation, Sonikation, Immunpräzipitation und Proteolyse. Tag zwei umfasst die pH-abhängige Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung zur Reinigung und Isolierung der methylierungsangereicherten DNA. Für das Verfahren sind einige spezielle Materialien erforderlich, darunter silanisierte Zentrifugenröhrchen, ein DNA-Sonikationsgerät, ein primärer Antikörper, anti-5-Methylcytosin-Maus, monoklonaler Antikörper, sekundärer Antikörper, Dynabeads, konjugiert mit Schafs-anti-Maus-IgG, sowie ein magnetischer Röhrchenhalter.

Der erste Schritt im Meetup-Protokoll ist die Vorbereitung der DNA. Es ist unerlässlich, die Beschaffenheit der DNA vorab zu beurteilen. Der Zustand der Proben-DNA, ob sie hauptsächlich doppel- oder einfachsträngig ist, muss bekannt sein, da eine genaue Quantifizierung der Probe von größter Wichtigkeit ist und verschiedene Methoden zur Bestimmung der DNA-Menge durch das Vorhandensein unerwünschter DNA-Arten negativ beeinflusst werden können.

Die Menge doppelsträngiger DNA kann einfach durch spektrale Photometrie mit einem NanoDrop 3 bestimmt werden. Laden Sie 1,5 Mikroliter auf und stellen Sie den Messmodus auf Nukleinsäure ein, wählen Sie DNA 50 als Berechnungsmethode und kalibrieren Sie das Gerät mit 1,5 Mikrolitern Wasser. Reinigen Sie die Messflächen und führen Sie eine Blindmessung mit 1,5 Mikrolitern der Flüssigkeit durch. Die Probe ist in der Lösung enthalten: Reinigen Sie die Messflächen, geben Sie 1,5 Mikroliter der Probe auf und drücken Sie „Messen“.

Die Konzentration wird angegeben und kann verwendet werden. Um die Anzahl der benötigten Mikroliter für mich zu berechnen, tauchen Sie ein A zwei 60 bis zwei 80 Verhältnis von 1,8 ist hier ideal. Eine Ein-Mikrogramm-Probe wird hergestellt.

Jedoch reicht eine Probe von nur 200 Nanogramm aus, um erfolgreiche Ergebnisse zu erzielen. Für das Meeting geben Sie die DNA-Probe in ein sauberes, silikonisiertes Röhrchen. Geben Sie so viel steriles Wasser hinzu, dass das Endvolumen 50 Mikroliter beträgt.

Die DNA-Sonikation und Immunpräzipitation müssen in silikonisierten Röhrchen durchgeführt werden, um unspezifische Bindung von DNA und Proteinen an die Röhrchenwände zu verhindern. Sobald die DNA vorbereitet wurde, muss die Probe sonisiert werden, da die Fragmentierung der DNA erforderlich ist, da die Immunpräzipitation mit kleineren DNA-Fragmenten effizienter ist. Laden Sie die Probe in den Sonikator, stellen Sie sicher, dass die Leistung auf hoch eingestellt ist, und dass die Maschine auf 30 Sekunden eingestellt ist. Nach 30 Sekunden Pause füllen Sie den Basisbehälter bis zur Füllmarkierung mit vier Grad Celsius kaltem Wasser.

Sonicieren Sie die Probe sieben Minuten lang. Sobald die Sonikation abgeschlossen ist, nehmen Sie das Röhrchen heraus und stellen es auf Eis. Es ist wichtig, die Sonikationsbedingungen vorab für Ihre erwartete Probe und die DNA-Größe zu optimieren.

Zum Beispiel erfordert eine teilweise degradierte DNA-Probe eine kürzere Sonikationszeit. Die Sonikationsprodukte können mit Standard-Elektrophoreseverfahren sichtbar gemacht werden. Zu diesem Zeitpunkt werden DNA-Fragmente mit einer Größe zwischen 300 und 1000 Basenpaaren für die spätere Verwendung angestrebt.

Bei Mikroarray- und PCR-Analysen sollten Sie ein Fünftel Ihrer DNA zurückbehalten, um als Input- oder Referenz-DNA zu dienen. In diesem Fall werden 800 Nanogramm sonifizierte DNA für die Immunpräzipitation verwendet, der Rest wird als Referenz-DNA aufbewahrt. Der nächste Schritt im Medienprotokoll ist die Immunpräzipitation oder IP-Reaktion. Vor der Zugabe des primären Antikörpers muss die DNA denaturiert werden. Die Denaturierung ist erforderlich, da der primäre Antikörper auf einzelsträngige DNA anspricht.

Platzieren Sie die Probe 10 Minuten lang in ein Wasserbad bei 95 Grad Celsius. Sobald der Denaturierungsschritt abgeschlossen ist, überführen Sie das Röhrchen unverzüglich für mindestens fünf Minuten auf Eis. Dies verhindert, dass die denaturierte DNA wieder in ihre ursprüngliche Struktur zurückkehrt, und ermöglicht eine optimale Antikörperbindung, sobald die Probe abgekühlt ist.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen kurz, um den Inhalt nach unten zu ziehen. Als Nächstes sollte der primäre Antikörper hinzugefügt werden. Die Menge des verwendeten Antikörpers sollte für jede Charge und jeden Hersteller titriert werden.

In diesem Fall geben wir fünf Mikrogramm Primärantikörper hinzu und fügen dann Immunspezifizierungs-Puffer oder IP-Puffer bis zu einem Endvolumen von 500 Mikrolitern hinzu. Anschließend wird die IP-DNA in einen Rotator gegeben und zwei Stunden bei vier Grad Celsius inkubiert. Die Rotation ist erforderlich, um eine Agglomeration der Antikörper innerhalb des Reaktionsgefäßes während der Inkubation zu verhindern.

Etwa 15 Minuten bevor die Inkubation mit dem primären Antikörper abgeschlossen ist, reinigen und bereiten Sie die magnetischen Dyna-Beads vor. Zunächst resuspendieren Sie die Beads im Fläschchen gründlich durch Vortexen. Danach überführen Sie 30 Mikroliter Beads in ein sauberes silanisiertes Röhrchen und stellen dieses Röhrchen für mehrere Reaktionen auf einen Magnetrack.

Übertragen Sie 30 Mikroliter Kügelchen pro Reaktion sowie ausreichend für eine zusätzliche Reaktion, um Pipettierfehler oder unbeabsichtigten Verlust einiger Kügelchen auszugleichen. Zum Beispiel für acht Reaktionen: Entnehmen Sie ausreichend Kügelchen für neun Reaktionen oder 270 Mikroliter.

Die magnetischen Kügelchen wandern zur Wand des Magnetracks. Lassen Sie zwei Minuten verstreichen, damit sich die Kügelchen zu einem deutlichen Streifen an der Röhrenwand absetzen können. Entfernen Sie anschließend vorsichtig mittels Pipette und verwerfen Sie die Überstände, wobei Sie darauf achten müssen, die Kügelchen an der Rückwand mit der Pipettenspitze nicht aufzuwirbeln.

Ersetzen Sie den Überstand durch ein Übermaß an IP-Puffer, wirbeln Sie die Probe und stellen Sie sie erneut für zwei Minuten auf den Magnetrack. Wiederholen Sie diese Waschung ein weiteres Mal und resuspendieren Sie die Waschperlen in ihrem ursprünglichen Volumen an IP-Puffer. Entnehmen Sie die Probenröhrchen vom Rotator, sobald die Inkubation beendet ist.

Um die Immunpräzipitation abzuschließen, 30 Mikroliter saubere Kügelchen zur Reaktion hinzufügen und das Gefäß für zwei Stunden bei vier Grad Celsius erneut in einen Rotator stellen. Während dieser Inkubation bindet der sekundäre Antikörper, der anti-maus-IgG ist, an den primären Maus-Antikörper. Die anti-Maus-Antikörper sind an magnetische Dyna-Kügelchen gekoppelt, wodurch eine einfache Rückgewinnung der gebundenen Produkte und der folgende Reinigungsschritt ermöglicht werden.

Nach Abschluss der Inkubation mit beiden Antikörpern wird das IP-Röhrchen für zwei Minuten auf den Magnetständer gestellt. Zu diesem Zeitpunkt ist die methylierte DNA durch den primären Antikörper gebunden, der seinerseits durch den mit Dynabeads konjugierten sekundären Antikörper gebunden wird. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter IP-Puffer.

Mischen Sie den Inhalt des Reaktionsgefäßes und stellen Sie es für zwei Minuten zurück auf das Gestell. Wiederholen Sie diese Waschung mit IP-Puffer ein weiteres Mal. Nach dem Entfernen des Überstandes aus der letzten Waschung Resus suspendieren Sie die Kügelchen zum abschließenden Mal.

In 400 Mikroliter Digestionspuffer die Reaktion mit 100 Mikrogramm Proteinase K behandeln und über Nacht bei 50 Grad Celsius inkubieren. Die Behandlung mit Proteinase K ist notwendig, um die Antikörperproteine und jegliche restlichen mit der DNA assoziierten Proteine abzubauen, wodurch die methylierte DNA in Lösung freigesetzt wird. Die DNA-Reinigung wird am zweiten Tag des Meetup-Verfahrens durchgeführt; holen Sie das Digestionsröhrchen aus dem Inkubator.

Fügen Sie in einer Abzugshaube 500 µL einer 1:1-Phenol-Chloroform-Lösung bei pH 7 dem Röhrchen hinzu und wirbeln Sie gründlich. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 10 Minuten bei 13.000 × g. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase aus dem Röhrchen, ohne die Grenzfläche zu stören oder Anteile der organischen Phase mitzunehmen. Überführen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen.

Eine zweite Extraktion kann durchgeführt werden, wenn die Phasengrenze trüb erscheint. Als Nächstes ein Zehntelvolumen dreimolarer Natriumacetat hinzufügen, in diesem Fall 40 µL. Ein Mikroliter Glykogen kann als Träger verwendet werden, um die Pellet-Reinigung zu erleichtern.

Vortexen Sie das Gefäß, um den Inhalt zu mischen. Geben Sie anschließend das Doppelte des Volumens an 100 %igem Ethanol hinzu, vortexen Sie erneut und frieren Sie die Probe 20 Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius ein. Nach dem Einfrieren wird die präzipitierte DNA in einer Zentrifuge bei 13.000 × g und 4 °C 20 Minuten lang pellettiert.

Ein DNA-Pellet bildet sich am Boden des Röhrchens. Nehmen Sie das Röhrchen aus der Zentrifuge und entfernen Sie das Ethanol. Achten Sie darauf, das Pellet am Boden des Röhrchens nicht aufzuwirbeln.

Ein Impulszentrifugieren kann notwendig sein, um verbleibenden Ethanol zu entfernen. Zum Waschen des Pellets 500 Mikroliter kalten, 70 %igen Ethanol hinzufügen, vortexen und erneut 20 Minuten bei 13.000 × g und 4 °C zentrifugieren. Sobald die zweite Zentrifugation abgeschlossen ist, den 70 %igen Ethanol abgießen, kurz zentrifugieren und den restlichen Ethanol mit einer Pipette entfernen.

Lassen Sie das Röhrchen auf einem Gestell mit geöffnetem Deckel, damit der Pellet trocknet und der restliche Ethanol verdunsten kann. Schließlich resuspendieren Sie den Pellet, der nur DNA angereichert für Methylierung enthält, in 10 Mikrolitern sterilem Wasser und lassen ausreichend Zeit, damit sich der DNA-Pellet vor der Verwendung vollständig auflösen kann. Es ist empfehlenswert, die Qualität der Isolierung durch PCR zu überprüfen.

Dies kann durch die Durchführung von PCR-Ansätzen erfolgen, die so konzipiert sind, dass sie Produkte amplifizieren, welche methylierte und unmethylierte DNA-Fragmente für normale menschliche DNA unterschiedlich darstellen. Die H19-Imprinting-Control-Region kann zusammen mit Primern verwendet werden, die darauf ausgelegt sind, einen Genomabschnitt zu amplifizieren, der nicht methyliert ist. Beispielhafte Primersequenzen und PCR-Zyklenbedingungen sind im beigefügten Protokoll angegeben.

An diesem Punkt ist es notwendig, die zu Beginn des Meetup-Protokolls beiseitegelegte Input- oder Referenz-DNA wiederzuverwenden. Ein Satz von PCR-Reaktionen wird unter Verwendung der Input-DNA eingerichtet, ein weiterer Satz unter Verwendung der für Methylierung angereicherten IP-DNA. Falls das Meetup erfolgreich war, wird die IP-PCR ein Produkt unter Verwendung der Methylierungsprimer und kein Produkt unter Verwendung der Kontrollprimer erzeugen.

Umgekehrt sollte die Eingabe-PCR Produkte mit beiden Primern erzeugen, da sie sowohl methylierte als auch unmethylierte DNA-Fragmente enthält. DNA, die angereichert ist für methylierte Fragmente, kann für eine Reihe nachgeschalteter Anwendungen verwendet werden, wie beispielsweise PCR-Sequenzierung und Microarray-Analyse.

In Kombination mit anderen Methoden der Molekularbiologie kann es verwendet werden, um den Methylierungsstatus der DNA ortsspezifisch oder genomweit für die Methylierungsprofilierung oder die Untersuchung der Epigenomik zu analysieren.