Selektive Markierung von Zelloberflächen-Proteinen unter Verwendung von CyDye DIGE Fluor Minimal Farbstoffe

Mein Name ist Maria und ich arbeite bei Y Healthcare in NOS in Schweden. Zelloberflächenproteine sind häufig an der Kommunikation zwischen Zellen und ihrer Umgebung beteiligt und deshalb von besonderem Interesse in der Forschung, um tiefere Einblicke in Krankheiten sowie andere biologische Variationen zu erhalten, die durch Veränderungen in der Zellumgebung hervorgerufen werden. In diesem Video werde ich Ihnen ein einfaches Side-Eye-Dodge-Protokoll zur Markierung von Zelloberflächenproteinen zeigen, mit dem Sie diese selten vorkommenden Proteine visuell anreichern können, ohne sie physikalisch zu verstärken, und die Unterschiede dieser Zelloberflächenproteine mithilfe der Technologie untersuchen können.

Wenn Sie diese Technologie interessant finden, können Sie weitere Informationen im 2D-Handbuch finden. Außerdem verfügen wir über ein Anwendungsnotiz zu diesem speziellen Thema, die Sie von job herunterladen können. In dem oben gezeigten Protokoll zur Zelloberflächenmarkierung markieren Sie die Zellen, während diese noch intakt sind. Während des Markierungsprozesses hat der Farbstoff nur Zugang zu den Zelloberflächenproteinen.

Nach dem Markierungsschritt werden die Zellen analysiert, um die spezifische Markierung der Zelloberfläche zu überprüfen. Die markierte Probe wurde in membran- und zytoplasmatische Proteine aufgeteilt. Parallel dazu wurde eine nicht fraktionierte Probe hergestellt.

Zum Vergleich ist diese Fraktionierungsanalyse nicht erforderlich, wurde hier jedoch durchgeführt, um zu zeigen, dass das Zelloberflächen-Protokoll spezifisch für Zelloberflächen-Pro-Tipps ist. Wir führten außerdem das Standard-ETH-Verfahren ohne Diätmarkierung durch, wie unten dargestellt: Die Zellen werden vor der Markierung lysiert, wodurch alle zellulären Proteine für die Markierung zugänglich sind. Nach dem Markierungsschritt werden die Proben der zweidimensionalen Elektrophorese unterzogen.

Adhärente Zellen werden mithilfe eines nichtenzymatischen Verfahrens abgelöst, um die Verdauung der gezielten Zelloberflächenproteine zu vermeiden. In diesem Protokoll verwenden wir den Gummispatel; alternativ ist jedoch auch die Verwendung eines enzymatischen Zelldissoziationsmediums möglich. Anschließend zählen und verteilen Sie die Zellsuspension auf Röhrchen mit jeweils fünf bis 10 Millionen Zellen. Die Zellen werden dann pelletiert und in H-P-S-S-P-H 7,4 gewaschen, um Reste der Zellkultur zu entfernen.

Medienkontaminationen durch Serumproteine und fluoreszierende Bestandteile können die Markierung und Detektion stören. Zellen, die im Suspensionswachstum vorliegen, werden direkt vor der Markierungsstufe nach dem Waschen pelletiert und gewaschen. Die Zellen werden in 200 Mikrolitern eiskaltem Markierungspuffer, der HPSS pH 8,5 und einmolares Harnstoff enthält, resuspendiert.

Überprüfen Sie für optimale Bedingungen zur Markierung von Zelloberflächenproteinen stets den pH-Wert. Vor der Markierung verwendeten wir 600 Pikomol Side-Eye pro 10 Millionen CHO-Zellen. Das optimale Verhältnis von Side-Eye zur Zellanzahl variiert je nach Zelltyp.

Da wir die genauen Protein-Konzentrationen auf der Zelloberfläche nicht kennen, wird in der Anleitung zu den Prinzipien und Methoden der zweidimensionalen Elektrophorese beschrieben, wie die optimalen Bedingungen für die Side-Eye-Markierung von Proteinen bestimmt werden. Die Zellen werden 20 Minuten lang im Dunkeln auf Eis mit Side-Eye-D-Floor, minimalem Würfel, inkubiert.

Nach der Markierungsreaktion wird der nichtreaktive Farbstoff durch Zugabe von 20 Mikrolitern 10-Millimolar-Lysin abgebrochen. Die markierten Zellen werden nun zweimal mit kaltem HPSS-Puffer, pH 7,4, gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Daher verbleibt im nächsten Schritt, der Zelllyse, kein freier Farbstoff für unerwünschte intrazelluläre Markierungen oder Proteine.

Die Proteine auf der Zelloberfläche sind nun markiert und die Zellen wurden gewaschen und sind bereit, lysiert zu werden. Das Pellet aus der letzten Waschstufe wird in 150 Mikroliter kaltem Lysepuffer resuspendiert, der sieben Mol Harnstoff, zwei Mol Thioharnstoff, 4 % CHAPS, 30 Millimol Tris und fünf Millimol Magnesiumacetat, pH 8,5, enthält, und für mindestens eine Stunde auf Eis unter gelegentlichem Vortexen belassen. Die Proben sind nun bereit für die zweidimensionale Trennung.

Der erste Schritt bei der Elektrophorese besteht darin, IPD-Streifen zur Wiederbefeuchtung vorzubereiten. Bereiten Sie die Wiederbefeuchtungslösung zu, indem Sie IPG-Puffer entsprechend dem pH-Intervall der verwendeten Streifen hinzufügen, und geben Sie die Lösung in die Mulden der Wiederbefeuchtungsschale. Entfernen Sie den Schutzfilm des IPG-Streifens und legen Sie die Streifen vorsichtig mit der trockenen Gel-Seite nach unten in die Wiederbefeuchtungsschale, die die Wiederbefeuchtungslösung enthält.

Schließen Sie den Deckel der IPG-Box und hydratisieren Sie die Streifen über Nacht. In der ersten Dimension, der isoelektrischen Fokussierung, werden die Proteine entsprechend ihrem pi getrennt. Dies erfolgt mithilfe des IPG four three.

Die rehydrierten Streifen werden in die Manifold gegeben und die Elektrode darauf montiert. Von jeder Probe wurden 50 Mikrogramm mit Hilfe von Probauftragungskappen aufgetragen. Wir haben entweder unfraktionierte Proben direkt ohne vorherige Fraktionierung aufgetragen oder die Proben vor der Auftragung in membran- und zytoplasmatische Fraktionen aufgeteilt.

Der Deckel wird geschlossen, um die fluoreszierenden Proben vor Licht zu schützen. Das Gerät wurde gemäß Empfehlung programmiert und über Nacht laufen gelassen. Große 12% Lamby-Gele wurden mit der Erwachsenen-12-Gel-Vorlage gegossen.

Es wurde eine Coster-Verdrängungslösung hinzugefügt, um polymerisierte Acrylgele in den Schläuchen zu vermeiden. Die Gele wurden vor der Verwendung über Nacht bei Raumtemperatur polymerisieren gelassen. Nach der isoelektrischen Fokussierung werden die Streifen entfernt und in zwei Schritten in einem Puffer mit SDS equilibriert, wobei zunächst DTT zur Reduktion der Disulfidbrücken der Cysteinreste verwendet wird, gefolgt von einer Alkylierung mit Acrylamid, um eine Modifikation durch Acrylamid zu verhindern.

Die IPG-Streifen werden in Laufpuffer getaucht und vorsichtig auf die großen zweidimensionalen Gele gelegt. Vermeiden Sie, Luft zwischen den Streifen und dem Gel einzuschließen, indem Sie eine geschmolzene 2%-Agarose-Lösung mit Bromphenolblau darauf geben. Die Gele sind nun bereit für die zweidimensionale SDS-Page-Trennung in der zweiten Dimension SDS-Page.

Die Proteine werden entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt, und dies erfolgt mit dem Tonal Six-System. Füllen Sie die Elektrophoresekammer mit anodischem Laufpuffer, setzen Sie die Gele ein und füllen Sie das obere Fach mit kathodischem Laufpuffer. Schließen Sie die Stromversorgung gemäß den Empfehlungen an und führen Sie die zweite Dimension lichtgeschützt für etwa vier bis fünf Stunden durch, oder bis die Farbstofffront das untere Ende des Gels erreicht hat.

Nach der zweidimensionalen Elektrophorese werden die Gelenkassetten mithilfe der Greifer im Typhoon-Fluoreszenzscanner platziert. Zwei Gele und drei Kanäle können gleichzeitig gescannt werden. Das Ergebnis dieser zweidimensionalen Gelelektrophorese zeigt eine hohe Auflösung von Membranproteinen in der Probe, obwohl einige bekannte Einschränkungen für die Detektion hydrophober Proteine in einer zweidimensionalen Gelelektrophorese bestehen. Die Ergebnisse zeigen zahlreiche neue, hier in Rot dargestellte, Zelloberflächenmarkierungspunkte, die mit dem hier in Grün dargestellten Standardmarkierungsprotokoll nicht detektiert werden.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Protokoll zur Markierung der Zelloberfläche eine hohe Spezifität für die Markierung von Proteinen der Zelloberfläche aufweist. Da ausschließlich Proteine der Zelloberfläche markiert werden, können sie leichter visualisiert werden und eine Abschwächung durch reichlich vorhandene zytosolische Proteine wird vermieden. Das fluoreszierende Bild von Gele mit nicht fraktioniertem Membrananteil oder zytosolischem Anteil ist oben dargestellt.

Unten ist ein Bild desselben Gels nach Silberfärbung dargestellt. Die Ergebnisse zeigen keine fluoreszenzmarkierten zytosolischen Proteine, doch die Silberfärbung zeigt, dass Proteine in den Gele vorhanden sind. Die Ergebnisse zeigen außerdem ähnliche Fleckenmuster aus nicht fraktionierten und Membranfraktionen, was belegt, dass eine Fraktionierung vor der zweidimensionalen Elektrophorese nicht erforderlich ist. Dadurch ist dieses Protokoll sowohl einfach als auch praktisch.

SI zwei, SI drei und SCI fünf weisen ähnliche Markierungsmuster auf und sind alle mit dem Zelloberflächenprotokoll kompatibel. Ein Ernährungsversuch wurde unter Verwendung aller drei Side-Eye-DI-Boden-minimal-Dy durchgeführt, um die differenzielle Expression von Zelloberflächenproteinen in CHO-Zellen nach Serumverarmung über unterschiedliche Zeiträume zu untersuchen. CY-zwei-Zelloberflächenproben aus allen Proben des Experiments wurden gepoolt und als interner Standard verwendet.

Die unterschiedlichen Veränderungen mehrerer Proteine der Zelloberfläche konnten während der Hungerphase verfolgt werden. Mithilfe des Zelloberflächenprotokolls wurden über 18 neuartige Membranproteine nachgewiesen, die mit dem Standardprotokoll zur Identifizierung der Proteine im präparativen Gel nicht detektiert wurden. Es war notwendig, die Probe der Zelloberfläche anzuspielen, um die Zuordnung zu den Spotpositionen im analytischen Datensatz zu ermöglichen.

Es ergeben sich Ergebnisse. Die Ergebnisse zeigen eine hohe Auflösung einer großen Anzahl von Zelloberflächenproteinen. Dieses Protokoll ist sehr spezifisch für Zelloberflächenproteine, und es wurde keine Markierung intrazellulärer Proteine beobachtet.

Mit dieser Methode können Sie mehr Oberflächenproteine von Zellen nachweisen als mit einem Standardprotokoll, und wie Sie bereits gesehen haben, ist es ein sehr einfaches Protokoll. Sie markieren einfach Ihre Zelloberflächenproteine, während diese noch intakt sind, und führen sie direkt der zweidimensionalen Elektrophorese zu, ohne eine Membranfraktionierung durchzuführen. Dies ist daher ein sehr gutes Protokoll, um Zelloberflächenproteine und deren Unterschiede mit der D-Technologie zu untersuchen.