Eine Technik für Serial Sammlung von Liquor aus der Cisterna Magna in Maus

Das Verfahren beginnt mit der Anästhesie der Maus und der Vorbereitung der Operationsstelle. Die Maus wird anschließend in Bauchlage auf dem stereotaktischen Instrument platziert. Ein sagittaler Schnitt durch die Haut wird unterhalb des Hinterhaupts vorgenommen, und das subkutane Gewebe sowie die Nackenmuskulatur entlang der Mittellinie werden stumpf separiert.

Dann wird der hintere Teil des Körpers so abgelegt, dass der Körper einen Winkel von 135 Grad mit dem fixierten Kopf bildet, das Dura mater des CI-Sternum magna wird mit der Glaskapillare durchstochen und die CSF wird gesammelt. Nach der CSF-Entnahme werden die Muskeln wieder in ihre ursprüngliche Lage gebracht und die Haut wird vernäht; etwa ein Milliliter 0,9 %iger NACL-Salzlösung wird subkutan injiziert, um Dehydration zu verhindern, und die Maus wird warmgehalten, bis sie sich erholt hat. Hallo, mein Name ist Liu aus dem Labor von Dr. Karen Duff am Top-Institut der Columbia University.

Heute zeige ich Ihnen, wie man zerebrospinale Flüssigkeit aus dem Zisterna magna der Maus gewinnt. Mit dieser Technik können wir serielle CSF-Proben bis zu dreimal von derselben Maus im Abstand von zwei bis drei Monaten sammeln. In unserem Labor verwenden wir diese Methode, um die CSF-Amyloid-beta- oder Tau-Konzentrationen in verschiedenen Altersstadien unserer transgenen Mausmodelle der Alzheimer-Krankheit zu bestimmen, und korrelieren diese Werte mit jenen aus dem Gehirn.

Am Ende interessiert uns das Potenzial der CSFA-Beta- oder Tau-Konzentrationen als mögliche biologische Marker für den Krankheitsverlauf sowie für therapeutische Studien an Mäusen. Beginnen wir also. Für dieses Verfahren ist es notwendig, Kapillaren mit einer Mikropipettenzugvorrichtung herzustellen.

Die hier verwendeten Kapillaren sind BOA-Silikatglas B 175 10 von Sutter Instruments; die Kapillaren werden auf einer Sutter P 87 Flammen-Mikropipettenzuganlage mit einem Heizindex von 300 und einem Druckindex von drei 30 gezogen. Die Glas-Kapillare ist fünf Zentimeter lang und weist eine konische Spitze auf. Die Spitze der Kapillare wird mit einer Schere abgeschnitten, sodass ihr Innendurchmesser etwa 0,5 Millimeter beträgt.

Der chirurgische Eingriff beginnt mit der Anästhesierung der Maus mittels Ketamin 100 Milligramm pro Kilogramm und Xylazin 10 Milligramm pro Kilogramm, die intraperitoneal verabreicht werden. Während der Anästhesie sollte die Maus in einem 37 Grad Celsius warmen Inkubator gehalten werden. Nachdem festgestellt wurde, dass das Tier vollständig anästhesiert ist – überprüft mittels Zehenquetschreflex –, rasieren Sie den Nacken und platzieren Sie die Maus anschließend auf einem stereotaktischen Instrument, beispielsweise diesem Modell von David Kopf. Bringen Sie dabei sicherstellen, dass die Maus direkt auf der Heizplatte liegt, und führen Sie eine rektale Temperatursonde ein, damit die Heizleistung entsprechend der Körpertemperatur der Maus angepasst werden kann.

Befestigen Sie den Kopf mit den Kopfadaptern, desinfizieren Sie die Halsregion dreimal abwechselnd mit 10% Povidon-Iod und 70% Ethanol und führen Sie einen sagittalen Schnitt unterhalb des hinteren Kopfanteils oder des Occiputs durch. Die folgenden Schritte sollten unter einem Dissektionsmikroskop mit stumpfen Pinzetten durchgeführt werden. Lösen Sie das subkutane Gewebe sowie die Muskeln M. ventor services und M. rectus capitis dorsalis major so voneinander, dass die Dura mater des Foramen magnum freigelegt wird. Verwenden Sie geeignete Mikroretraktoren, um die Muskeln auseinanderzuhalten.

Legen Sie die Maus schließlich so hin, dass der Kopf in einem Winkel von 135 Grad zum Körper liegt. Die Maus ist nun bereit für die CSF-Gewinnung. Diese Technik zur Gewinnung von CSF über das Foramen magnum wurde bereits früher veröffentlicht.

Abbildung C1A unter dem Stereomikroskop. Die Dura mater erscheint als glänzendes, durchsichtiges umgekehrtes Dreieck, durch das das Medulla oblongata und ein größeres Blutgefäß sichtbar sind. Arteria dural spinella, Abbildung C1B. Die pulsatile Durchblutung des Medulla oblongata und des angrenzenden Liquorraums ist erkennbar.

Trocknen Sie die Dura mater mit einem sterilen Wattestäbchen ab, führen Sie die Kapillare lateral zur Arteria dorsalis spinalis durch die Dura mater in das hintere Sternum magna ein. Beim korrekten Einführen der Kapillare tritt ein spürbarer Widerstandswechsel auf, und dann fließt Liquor cerebrospinalis (CSF) in die Kapillare ein. Nach der vorsichtigen Entnahme der Kapillare verbinden Sie diese mittels eines Polyethylen-Schlauchs mit einem Drei-Milliliter-Spritzen, wobei der Schlauch einen Innendurchmesser von einem Millimeter aufweist.

Injizieren Sie die Liquor cerebrospinalis in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen. Beschriften Sie das Röhrchen und frieren Sie es sofort auf Trockeneis ein. Nach dem Einfrieren überführen Sie den Liquor in einen minus 80 Grad Celsius kalten Gefrierschrank.

Die gerade demonstrierte Entnahmetechnik ist äußerst schonend und ermöglicht es, anschließend über einen Zeitraum von zwei bis drei Monaten weitere CSF-Proben vom selben Maus zu entnehmen. Daher sollten nach der Probenentnahme Nacken, Muskulatur und Haut wieder richtig ausgerichtet und mit Nähten verschlossen werden. Nachdem der Schnitt vernäht ist, injizieren Sie etwa ein Milliliter physiologische Kochsalzlösung (0,9 % NACL) subkutan, um die Maus zu rehydrieren.

Halten Sie die Maus bis zur Genesung bei etwa 37 Grad Celsius warm. Überwachen Sie das Gewicht am ersten und siebten Tag nach der Operation. Ich habe Ihnen soeben gezeigt, wie man Liquor cerebrospinalis aus dem Cisterna-magna-System der Maus gewinnt.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind drei wichtige Punkte zu beachten. Erstens sollte der Kopf und der Körper der Maus korrekt am stereotaktischen Rahmen positioniert werden, sodass das Atrium des Cy Magna so weit wie möglich freigelegt wird. Zweitens müssen die Blutgefäße sorgfältig vermieden werden, wenn die Dura mit der Kapillare durchstochen wird.

Andernfalls wird Ihre Probe durch das Blut kontaminiert. Nicht zuletzt sollten Sie darauf achten, Ihre Mäuse während des gesamten Verfahrens warm zu halten, um eine Hypothermie zu verhindern. Hypothermie ist nicht nur schädlich für Ihre Mäuse, sondern kann auch Ihre Ergebnisse erheblich beeinflussen, indem sie eine Beta-Produktion oder eine veränderte Hypophosphorylierungsrelation induziert.

So, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.