Ensayos de clonalidad mediante secuenciación de nueva generación: validación clínica para la monitorización de la enfermedad residual mínima en el mieloma múltiple

Resumen

Este estudio evaluó un nuevo ensayo de clonalidad de BCR/TCR basado en NGS (OriMIRACLE LTM) para la detección de enfermedad residual mínima en malignidades linfoides, incluyendo mieloma múltiple (MM). Mediante el uso de líneas celulares y frotis clínicos, mostró una tasa de detección >90 % y una concordancia del 81,36 % con citometría de flujo. El ensayo ofrece alta sensibilidad, predice la recaída y apoya las decisiones terapéuticas.

Resumen

La detección de enfermedad residual mínima (ERM) es fundamental para el manejo de las malignidades linfoides. En este estudio se presenta OriMIRACLE LTM, un nuevo ensayo basado en secuenciación de nueva generación (NGS) para la detección de clonalidad del receptor de células B (BCR) y del receptor de células T (TCR), dirigido a la identificación de ERM. El ensayo fue validado mediante líneas celulares y muestras clínicas, incluidos frotis residuales, de pacientes con mieloma múltiple (MM). El ensayo de clonalidad BCR/TCR mostró una tasa de detección positiva superior al 90 % en las malignidades linfoides. Los estudios de validación en pacientes con MM mostraron una concordancia del 81,36 % (48/59) entre la citometría de flujo multicolor (MFC) y la evaluación de la respuesta clínica en la detección de células tumorales. Destacablemente, el 61,11 % (11/18) de los pacientes con MM que resultaron positivos para ERM mediante NGS y MFC presentaron progresión de la enfermedad o recidiva. Los pacientes con ERM detectada únicamente mediante NGS mostraron tasas más bajas de respuesta clínica completa, y algunos pacientes con MM que inicialmente respondieron tuvieron recidiva tras la interrupción del tratamiento. Estos hallazgos indican que este ensayo basado en NGS permite una detección altamente sensible y específica de ERM en las malignidades linfoides, incluso en muestras de frotis residuales derivadas de pacientes con MM. El método presenta ventajas frente a la MFC y resulta valioso para el seguimiento de ERM. En conclusión, las evidencias actuales respaldan el uso de NGS como herramienta complementaria a la MFC, especialmente en pacientes MFC⁻/NGS⁺, ya que NGS permite una estratificación de riesgo más profunda. Sin embargo, el umbral óptimo de intervención deberá determinarse mediante estudios prospectivos.

Introducción

El mieloma múltiple (MM) es una neoplasia hematológica caracterizada por la proliferación de células plasmáticas aberrantes y clonales en la médula ósea¹. En China, en 2022 se registraron aproximadamente 22 450 nuevos diagnósticos de MM y 17 360 muertes relacionadas². A pesar de los significativos avances en el tratamiento del MM durante la última década, que han prolongado sustancialmente la supervivencia mediana de los pacientes, la mayoría de los pacientes finalmente experimentan una recaída^3,4. Este notable aumento subraya la necesidad crítica de un monitoreo preciso de la remisión, la predicción temprana de la recaída y la realización oportuna de intervenciones terapéuticas.

La evidencia clínica ha establecido firmemente la importancia pronóstica del estado de enfermedad residual mínima (MRD) en las malignidades hematológicas^5,6,7. Reconociendo su relevancia, el Grupo Internacional de Trabajo sobre Mieloma (IMWG) incorporó la evaluación de MRD en sus criterios de evaluación de respuesta en 2016⁸. Los métodos actuales para la evaluación de MRD en médula ósea incluyen la reacción en cadena de la polimerasa con oligonucleótidos específicos de alelo (ASO-PCR), la PCR digital (dPCR), la citometría de flujo multiparamétrica (MFC) y los ensayos de secuenciación de nueva generación (NGS)⁸. Aunque la ASO-PCR ofrece una detección sensible, es un método lento y difícil de estandarizar debido al requerimiento de cebadores específicos para cada paciente^9,10. De manera similar, la dPCR está limitada por su diseño específico de alelo^10,11. La MFC ha sido fundamental en la detección de MRD¹², proporcionando información rápida a nivel celular, pero enfrenta dificultades con la estandarización y la reproducibilidad.

La secuenciación de nueva generación (NGS) presenta un enfoque reproducible y altamente sensible que elimina la necesidad de cebadores específicos para cada paciente. Permite la identificación y cuantificación fiable de reordenamientos únicos de inmunoglobulinas en neoplasias hematológicas¹³. La Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. (FDA) ha aprobado ClonoSEQ de Adaptive Biotechnologies para la detección de enfermedad residual mínima (MRD) en pacientes con leucemia linfoblástica aguda (ALL), mieloma múltiple (MM) y leucemia linfocítica crónica (CLL)^14,15,16. Numerosas guías clínicas internacionales incluyen ahora la NGS como un método recomendado para el monitoreo de MRD. Las Guías Chinas para el Diagnóstico y Tratamiento del Mieloma Múltiple (Revisadas en 2020) también recomiendan la evaluación de MRD en pacientes con mieloma múltiple mediante métodos como la citometría de flujo de nueva generación (NGF) y la NGS¹⁷.

Hasta donde sabemos, la tecnología de NGS no es el método preferido para la detección de enfermedad residual mínima (MRD) en malignidades linfoides en la práctica clínica debido a las limitaciones de costo y tiempo. Cuando los resultados de la MFC son negativos, a menudo es necesario realizar una aspiración adicional de médula ósea para detectar la MRD. Este procedimiento adicional puede imponer cargas físicas y psicológicas significativas a los pacientes, lo que potencialmente limita su aplicación clínica generalizada.

En este estudio, desarrollamos, caracterizamos y validamos el rendimiento de un ensayo de clonalidad de receptores de células B o T (BCR/TCR) basado en NGS (OriMIRACLE LTM). Los objetivos principales de este estudio fueron validar la sensibilidad y especificidad de este ensayo para el seguimiento de la enfermedad residual mínima (MRD) en malignidades linfoides, incluso cuando se utilizan muestras de frotis residuales. Este método puede utilizar directamente frotis residuales de médula ósea sobrantes del diagnóstico rutinario, superando así las limitaciones inherentes de las muestras de frotis. Incluso cuando el ADN en los frotis está fragmentado debido a la fijación, tinción y almacenamiento prolongado, presente en cantidades extremadamente bajas o parcialmente degradado, es posible obtener perfiles confiables del repertorio inmune mediante una extracción optimizada de ácidos nucleicos y una amplificación por PCR múltiple. Permite un seguimiento clonal de alta sensibilidad con una sensibilidad de 10⁻⁵ a 10⁻⁶, superando el límite inferior de detección de la citometría de flujo convencional basada en MRD. Este trabajo destaca el potencial de la evaluación de clonalidad de BCR/TCR basada en NGS para mejorar el seguimiento de la MRD y orientar las decisiones terapéuticas en pacientes con mieloma múltiple (MM), posiblemente abordando las limitaciones actuales en la práctica clínica.

Protocolo

Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan (número de aprobación ética: 22SC-2023011201). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes antes de su inclusión en el estudio.

Selección de muestras
Se obtuvieron muestras clínicas de 40 pacientes diagnosticados con diversas neoplasias hematológicas, incluyendo LLA, MM, LLC y linfoma. Además, se recolectaron muestras pareadas de fase crónica y fase blástica de pacientes con leucemia mieloide crónica. Las muestras se obtuvieron del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Gannan, Jiangxi, China, entre diciembre de 2016 y agosto de 2022. Estos especímenes se derivaron de aspirados de médula ósea (AMO) o sangre periférica. También se utilizaron cuatro líneas celulares de neoplasias linfoides: las líneas de LLA-B REH y NALM6, la línea de LLA-T Jurkat y la línea de linfoma H9, todas adquiridas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; Manassas, VA).

Para el estudio de validación analítica, se incluyó un subconjunto de extensiones clínicas pareadas de médula ósea residual, recolectadas antes y después del tratamiento, de 30 pacientes con MM recién diagnosticado o en recaída. Los ensayos de MFC se realizaron en muestras de BMA en los puntos temporales correspondientes utilizando citometría de flujo de 4 colores.

Las muestras se tiñeron con seis combinaciones diferentes de anticuerpos de 4 colores (diluciones según las instrucciones del fabricante): CD38/CD56/CD45/CD19, CD38/CD138/CD45/CD34, CD38/CD117/CD45/CD33, CD38/CD22/CD45/CD20, CD38/CD9/CD45/HLA-DR, y K/L/CD45/CD38. La tinción se realizó durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad, seguida de dos lavados con PBS (centrifugación a 500 × g durante 5 minutos a 4 °C). En los laboratorios de inmunohematología, actualmente se define la positividad de MFC-MRD en médula ósea utilizando un umbral de 10^-4 (1 célula en 10.000). La calidad de la adquisición por citometría de flujo se verificó visualizando la dispersión directa/lateral y confirmando al menos 10.000 eventos CD45⁺ por tubo.

Detección de clonalidad y seguimiento de la enfermedad residual mínima mediante el ensayo de clonalidad basado en NGS
El ADN genómico se extrajo de 200 µL de aspirado medular, sangre periférica o de toda la extensión residual (resuspendida en 200 µL de PBS) utilizando el kit correspondiente según las instrucciones del fabricante. Se requirió una concentración mínima de ADN genómico de 20 ng/µL y un rendimiento total ≥ 1 µg. Se verificó una relación A260/A280 de 1,8–2,0. Este ensayo amplifica el ADN genómico mediante PCR múltiple específica de locus con cebadores, seguida de la adición de un código de barras de índice de especificidad de reacción a la secuencia del receptor amplificada para la identificación de la muestra. El ADN amplificado con código de barras se agrupa luego para preparar bibliotecas de secuenciación, que se someten a NGS utilizando la plataforma Illumina. Se verificó un tamaño final de biblioteca de 350–450 bp y una concentración ≥ 5 nM en el Bioanalyzer. Los datos de secuenciación se procesan utilizando tuberías bioinformáticas personalizadas y medidas rigurosas de control de calidad. Las lecturas se asignan a los receptores BCR o TCR reordenados para cada muestra y se agrupan en secuencias de receptores clonales. Luego, estas secuencias se evalúan en cuanto a su potencial relacionado con la enfermedad y su idoneidad para el seguimiento posterior. Para considerar una secuencia adecuada, esta debe constituir al menos el 10 % de todas las secuencias de BCR en el locus dado y demostrar suficiente unicidad. Al evaluar una secuencia para el seguimiento de la enfermedad residual mínima, su unicidad se determina comparándola con una base de datos integral del repertorio de células B o T, como la base de datos ImMunoGeneTics (IMGT) (http://www.imgt.org). La frecuencia de la secuencia en esta base de datos se utiliza para evaluar su singularidad. Una vez identificadas las secuencias relacionadas con la enfermedad adecuadas, se comparan con muestras posteriores para monitorear la enfermedad residual mínima. Las muestras se clasifican como positivas (+) para enfermedad residual mínima si se encuentran coincidencias de secuencias, o negativas (–) si no se detectan coincidencias. Se cuantifica la concentración de cada secuencia monitoreada, lo que permite calcular el número consenso de células malignas y el número total de células nucleadas a nivel de la muestra. La relación entre estas cifras proporciona una estimación de la frecuencia de células tumorales dentro de una muestra, ofreciendo información valiosa sobre la progresión o remisión de la enfermedad. Se consideró válida para el seguimiento una secuencia clonal si se detectaron al menos 50 lecturas de apoyo y la secuencia representaba ≥10 % del repertorio total de BCR/TCR en el momento del diagnóstico.

Todas las muestras de origen humano se manipularon como material biopeligroso en una cabina de seguridad biológica de Clase II (CSB) con equipo de protección personal (EPP). Los consumibles contaminados se autoclavaron (121 °C, 20 min) antes de su eliminación; los desechos líquidos se trataron con lejía al 10 %.

Estudios de precisión y sensibilidad
El límite de detección (LOD) se determinó utilizando muestras clínicas y líneas celulares frente a un fondo de ADN genómico (gDNA) de sangre periférica de donantes sanos. Para establecer la linealidad de la detección, se agregó ADN genómico de líneas celulares a ADN genómico normal, creando un rango de frecuencias clonales que abarcaba varios órdenes de magnitud. Específicamente, se agregaron células malignas comenzando con 10 células, seguido de diluciones seriadas de 10 veces: 10, 100, 1 000 y 10 000 células. El LOD se calculó como el número esperado de células malignas de entrada en el que la curva de probit ajustada alcanzó una probabilidad de detección del 95 %. La consistencia entre las frecuencias observadas y esperadas se analizó mediante regresión lineal. Estos parámetros proporcionan una base sólida para la estimación de MRD a nivel de muestra en estudios posteriores de evaluación. Esta versión refinada mantiene el tono académico mientras mejora la claridad y la concisión, y asegura el uso adecuado de la terminología científica y el cumplimiento de las convenciones de la escritura académica en el campo de las ciencias de la vida y la medicina.

Análisis estadístico
Bilateral p < Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. La linealidad se evaluó y calculó mediante el coeficiente de correlación de Pearson (r) en GraphPad Prism. El análisis estadístico se realizó con el lenguaje R (versión 3.6.1). El cálculo de la supervivencia libre de progresión (SLP) comienza en el momento en que el paciente alcanza respuesta completa (RC), respuesta parcial (RP) o respuesta parcial muy buena (RPMB), y continúa hasta la aparición de enfermedad progresiva (EP) o muerte por cualquier causa. Se utilizó la curva de Kaplan-Meier para analizar la supervivencia, y la prueba de log-rank para comparar las diferencias en la supervivencia entre subgrupos. El análisis de Cox se realizó mediante análisis univariante y multivariante.

Resultados

El procesamiento, linealidad y precisión de la detección de clonalidad
Los ensayos de clonalidad de BCR/TCR se basaron en dos rondas de PCR múltiple seguidas de NGS (Figura 1). Los ensayos de clonalidad de BCR podían identificar reordenamientos de IGH (VH-DH-JH o DH-JH), IGK (Vκ-Jκ, Vκ-Kde y intronRSS-Kde), e IGL (Vλ-Jλ), así como translocaciones BCL1-IGH y BCL2-IGH, mediante reacciones separadas o una única reacción mixta ajustada. Los ensayos de clonalidad de TCR podían detectar reordenamientos de TCRB (Vβ-Dβ-Jβ) y TCRG (Vγ–Jγ). La clonalidad de BCR en las neoplasias linfoides de células B mostró una tasa de detección del 93,94 %, y la clonalidad de TCR en las neoplasias linfoides de células T mostró una tasa de detección del 90,91 % (Tabla 1).

Se demostró linealidad en un amplio rango de entradas de muestra (0,2 µg, 2 µg y 20 µg) basado en los resultados de pruebas con líneas celulares, abarcando varios órdenes de magnitud. Para establecer la linealidad, se agregaron células malignas a ADN genómico normal mediante diluciones seriadas de 10 veces (10, 100, 1.000 y 10.000 células). Se observó linealidad con pendientes estimadas entre 0,93 y 1,06 en frecuencias clonales desde 1 hasta 10^-6 (Figura 2A). Se estimó que el LDD se encontraba entre 1 y 2 células malignas en ambos ensayos de clonalidad de BCR y TCR (Figura 2B). Además, los ensayos de clonalidad de BCR/TCR fueron capaces de detectar clonalidad en linfoma utilizando muestras de tejido (BMA) y sangre periférica emparejada (Tabla Suplementaria 1).

Pacientes y muestras utilizadas para validar la detección de enfermedad residual mínima
La validación de la detección de enfermedad residual mínima incluyó un total de 29 pacientes con mieloma múltiple, excluyéndose un paciente debido a daño de la muestra. La población del estudio consistió en un 65,52 % (19/29) de hombres y un 34,48 % (10/29) de mujeres, con una edad mediana de 65 años (rango 33–82) (Tabla 2). Dentro de la cohorte, el 31,03 % (9/29) de los pacientes se clasificaron como alto riesgo, el 24,14 % (7/29) como riesgo estándar y el 37,93 % (11/29) como bajo riesgo según los criterios del IMWG¹⁸. Las etapas del sistema internacional revisado de estadificación del mieloma múltiple (R-ISS) I, II y III representaron el 10,34 % (3/29), el 48,28 % (14/29) y el 20,69 % (6/29) de los pacientes, respectivamente¹⁹.

Comparación de los ensayos NGS y MFC
Se realizó una comparación directa por pares para evaluar la precisión cuantitativa de los ensayos OriMIRACLE LTM y MFC. Los resultados mostraron una precisión cuantitativa similar en el rango evaluado, especialmente en frecuencias de RMN superiores a 10⁻⁴, con un valor de correlación de Pearson R de 0.73 (Figura 3). Las células tumorales fueron detectadas por ambos ensayos, MFC y NGS, en 59 muestras de 29 pacientes con MM, y la concordancia alcanzó el 81,36 % (48/59). Esta concordancia refleja la presencia de células tumorales detectables en diferentes momentos, más que una concordancia verdadera entre los métodos. De las muestras, el 62,07 % (18/29) resultó en RMN+ según ambos ensayos, NGS y MFC; un paciente resultó en RMN− por ambos métodos, y 11 pacientes resultaron en RMN+ por NGS pero RMN− por MFC. Entre los pacientes con resultados de detección inconsistentes, tres presentaron una frecuencia de detección inferior a 10^-4, mientras que ocho tuvieron una frecuencia de detección dentro del rango de 10^-2–10^-4 (Figura 3). La extracción de ADN a partir de muestras residuales de frotis de médula ósea se realiza para obtener la mayor cantidad posible de ADN. Para la detección de clonalidad antes del tratamiento, se analizó un promedio de 91,95 ng (hasta 100,0 ng) de ADN de entrada. Se extrajo un promedio de 1623,39 ng de ADN (con un rango de 50,1–17400,0 ng) para las pruebas posteriores de RMN (Tabla Suplementaria 2). Los resultados revelaron que NGS puede detectar RMN incluso cuando la muestra residual es insuficiente, mientras que MFC no logró detectar RMN en algunos casos.

Validez clínica de la detección de enfermedad residual mínima mediante ensayo de secuenciación de nueva generación para el intervalo principal
Se detectaron secuencias clonales en el momento basal en todos los pacientes con mieloma múltiple, seguido de la evaluación de la enfermedad residual mínima (Figura 4). Dieciocho pacientes fueron confirmados como MRD+ mediante detección por NGS y citometría de flujo multiparamétrica (MFC). Entre los pacientes con resultado MRD+ por ambas técnicas (MFC y NGS), el 61,11 % (11/18) presentó progresión de enfermedad o recaída posteriormente. El 38,89 % (7/18) de los pacientes alcanzó enfermedad estable (SD) o respuesta parcial (PR) durante el estudio. Entre los pacientes con resultado MRD+ por NGS pero MRD− por MFC, el 36,36 % (4/11) no logró alcanzar una respuesta completa clínica en la evaluación clínica más reciente (Tabla Suplementaria 2). Además, entre todos los pacientes cuya respuesta clínica fue respuesta completa, el 37,50 % (3/8) presentó recaída tras la interrupción del tratamiento. También analizamos las características clínicas primarias y los resultados de MFC en relación con el resultado de la supervivencia libre de progresión (Figura Suplementaria 1). Los análisis univariante y multivariante de la supervivencia libre de progresión revelaron que no existía una relación significativa. En este estudio, no se observó una diferencia significativa en la supervivencia libre de progresión al analizar únicamente los resultados de enfermedad residual mínima obtenidos mediante citometría de flujo multiparamétrica (MFC).

DISPONIBILIDAD DE LOS DATOS
Debido a restricciones de privacidad del paciente y políticas institucionales, los datos brutos no están disponibles públicamente. Se proporciona un resumen de los datos recopilados en el Archivo Suplementario 1.

Figura 1: El ensayo de clonalidad de BCR/TCR implicó PCR múltiple seguida de NGS. La PCR de primera ronda amplificó la región CDR3 de los genes de receptores inmunes reorganizados utilizando cebadores específicos del locus e índices específicos de la muestra, y los adaptadores de NGS se añadieron durante la PCR de segunda ronda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Se evaluó la linealidad de la detección de clonalidad mediante la adición de ADN genómico de líneas celulares a ADN genómico normal en un rango de frecuencias clonales. (A) Linealidad de los ensayos de clonalidad de BCR y TCR. (B) Límite de detección (LOD) estimado utilizando muestras clínicas y líneas celulares agregadas al ADN genómico de sangre periférica de donantes sanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación por pares de las mediciones de frecuencia de RM por MFC y el ensayo de RM por NGS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: La dinámica de la enfermedad mínima residual en pacientes con mieloma múltiple y los diferentes estados clínicos de los pacientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipos de muestras		Nº	Tipo de enfermedad	Clonotipo dominante
Líneas celulares	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	Linfoma	TCRB, TCRG
Malignidades linfoides clínicas de células B		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	No detectado
		9	LLC	IGH, IGK
		10	LLC	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	Linfoma	IGH, IGK
		24	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		25	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		26	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		27	Linfoma	IGH
		28	Linfoma	IGH
		29	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		30	Linfoma	IGH, IGK
		31	Linfoma	IGH, IGK
		32	Linfoma	IGH, IGK, IGL
		33	Linfoma	IGK
		34	Linfoma	IGH
		35	Linfoma	No detectado
Malignidades linfoides clínicas de células T		36	Linfoma	TCGR
		37	Linfoma	TCRB, TCRG
		38	Linfoma	TCRB, TCRG
		39	Linfoma	TCRB, TCRG
		40	Linfoma	TCRB, TCRG
		41	Linfoma	TCRB, TCRG
		42	Linfoma	TCRB, TCRG
		43	Linfoma	TCRB, TCRG
		44	Linfoma	No detectado

Tabla 1: Detección de clonalidad mediante los ensayos de clonalidad de BCR/TCR en 4 líneas celulares y 40 muestras clínicas. B-ALL: Leucemia linfoblástica aguda de células B; T-ALL: Leucemia linfoblástica aguda de células T; CP-CML: Leucemia mieloide crónica en fase crónica; BP-CML: Leucemia mieloide crónica en fase blástica; CLL: Leucemia linfocítica crónica; MM: Mieloma múltiple.

Característica	Total (N = 29)
Edad mediana, años (rango)	65 (33-82)
Género, n (%)
Hombre	19 (65,52)
Mujer	10 (34,48)
Tipo de cadena pesada, n (%)
IgG	14 (48,28)
IgA	7 (24,14)
IgE	1 (3,45)
Tipo de cadena ligera, n (%)
k	19 (65,52)
λ	8 (27,59)
Anomalía citogenética, n (%)
del17p	2 (6,90)
del13q14	9 (31,03)
ganancia/amplificación 1q21	12 (41,38)
t (4;14)	2 (6,90)
Sin anomalías	9 (31,03)
Estadio ISS, n (%)
I	4 (13,79)
II	13 (44,83)
III	12 (41,38)
Estadio R-ISS, n (%)
I	3 (10,34)
II	14 (48,28)
III	6 (20,69)
Faltante	6 (20,69)
IMWG, n (%)
Alto riesgo	9 (31,03)
Riesgo estándar	7 (24,14)
Bajo riesgo	11 (37,93)
Faltante	2 (6,90)

Tabla 2: Características basales de los 29 pacientes con MM incluidos en este estudio. k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: sistema de estadificación internacional; R-ISS: sistema de estadificación internacional revisado; IMWG: Grupo de Trabajo Internacional sobre Mieloma

Figura suplementaria 1: Análisis de supervivencia basado en características clínicas y resultados de MFC. (A) Análisis univariado y multivariado de la SLP. (B) Curva de Kaplan-Meier con el resultado de MFC. (C) Curva de Kaplan-Meier con el resultado de NGS. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 1: Detección de clonalidad del linfoma mediante ensayos de clonalidad del BCR/TCR en muestras de tejido y sangre periférica emparejada. NHL: linfoma no Hodgkin; HGBL: linfoma de células B de alto grado; FL: linfoma folicular; DLBCL: linfoma de células B grandes difuso; ITLPD-GI: trastornos linfoproliferativos T indolentes del tracto gastrointestinal. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria 2: Resultados de la detección de enfermedad residual mínima basados en ensayos de citometría de flujo multiparamétrica (MFC) y secuenciación de nueva generación (NGS). ND: no detectado; Respuesta parcial: RP; Respuesta completa: RC; Enfermedad estable: EE; Respuesta parcial muy buena: RPMB. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 1: Resumen de los datos brutos recopilados en este estudio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

En los últimos años se han observado mejoras significativas en los resultados clínicos de las malignidades linfoides, lo que ha impulsado la búsqueda de marcadores alternativos capaces de predecir los desenlaces de supervivencia con mayor anticipación y acelerar la evaluación de nuevas terapias²⁰. Un metaanálisis exhaustivo que incluyó a 8.098 pacientes ha reafirmado el sólido valor pronóstico de la negatividad de la enfermedad residual mínima (MRD) para mejorar la supervivencia a largo plazo en pacientes con mieloma múltiple (MM)²¹. Además, las reordenaciones clonales de BCR y TCR han surgido como marcadores cruciales para el diagnóstico y el seguimiento de la MRD, orientando las decisiones terapéuticas en las malignidades del sistema linfático²².

Cada vez hay más evidencia que respalda la superioridad de la evaluación de la clonalidad de BCR/TCR basada en NGS frente a los ensayos basados en MFC y PCR, especialmente cuando se dispone de muestras de ADN abundantes. La NGS ofrece una mayor sensibilidad y una estandarización más sencilla^{10,23,24,25,26} y se ha identificado como un factor pronóstico sólido tanto para la supervivencia libre de progresión como para la supervivencia global al inicio de la terapia de mantenimiento²⁷.
En este estudio, desarrollamos un ensayo basado en NGS que demuestra una tasa de detección positiva superior al 90 % tanto para la clonalidad de BCR como de TCR en las neoplasias linfoides. El LDD del ensayo se estima entre 1 y 2 células malignas tanto para el ensayo de clonalidad de BCR como de TCR, comparable a la alta sensibilidad del ensayo clonoSEQ, cuyo LDD es de 1,903 células malignas¹⁶. Observamos linealidad con pendientes estimadas entre 0,93 y 1,06 en frecuencias clonales desde 1 hasta 10^-6, lo que indica una fuerte proporcionalidad entre las frecuencias clonales observadas y esperadas. Tras establecer métodos de detección estandarizados y completar la validación en laboratorio, realizamos una validación clínica para garantizar la idoneidad del ensayo en el monitoreo clínico de la enfermedad residual mínima.

Este estudio reveló una concordancia del 81,36 % (48/59) entre el ensayo basado en NGS y la MFC. Ambos métodos mostraron una sensibilidad del 100 % para identificar células tumorales en casos recién diagnosticados o con recaída. Para el monitoreo posterior al tratamiento, no se encontró una correlación significativa entre el estado de enfermedad residual mínima evaluado mediante MFC y la supervivencia libre de progresión, probablemente debido al tamaño limitado de la muestra. En consecuencia, realizamos un análisis exhaustivo de todos los casos.

Entre los 18 pacientes identificados como positivos para MRD por ambos métodos, los resultados de MRD coincidieron con las evaluaciones de respuesta clínica. Nueve de estos pacientes presentaron progresión de la enfermedad (PD) o recaída, cuatro lograron enfermedad estable (SD), cuatro lograron respuesta parcial (PR) y uno falleció. Esto sugiere que, en pacientes con resultado positivo para MRD por ambos métodos, casi invariablemente se observa progresión de la enfermedad o recaída. Estos datos indican que la positividad para MRD en los ensayos de NGS y MFC refleja principalmente una eficacia limitada o un mal pronóstico en estos pacientes. De los 11 pacientes que resultaron positivos para MRD por NGS pero negativos por MFC, el 36,36 % no logró una respuesta completa (CR). Estos hallazgos subrayan la capacidad del NGS para detectar MRD en frecuencias que van desde 10^-2 hasta 10^-6, incluso con muestras residuales limitadas, mientras que la MFC no logró detectar MRD en algunos casos. Esto respalda aún más la mayor sensibilidad y especificidad del NGS en la detección de MRD en comparación con la MFC.

Investigaciones previas han demostrado que el estado de enfermedad mínima residual (MRD) evaluado mediante citometría de flujo multiparamétrica (MFC) es un fuerte predictor del tiempo libre de progresión (PFS) y de la supervivencia global en pacientes con mieloma múltiple (MM), lo que subraya la importancia del monitoreo de MRD para orientar las decisiones terapéuticas y evaluar el pronóstico tras el trasplante autólogo de células madre²⁸. Los resultados aquí presentados resaltan aún más la relevancia de los ensayos mediante secuenciación de nueva generación (NGS), como lo ejemplifican dos casos (pacientes 11 y 14) en los que los pacientes resultaron negativos para MRD por MFC, pero positivos por NGS. Es fundamental tener en cuenta que la interrupción del tratamiento en estos casos podría conllevar un riesgo de recaída, lo que pone de manifiesto la necesidad de una evaluación cuidadosa de la respuesta al tratamiento cuando se observan resultados discordantes de MRD.

Este estudio rompe la dependencia de los métodos existentes de NGS y MFC respecto a aspirados de médula ósea frescos o células congeladas y, por primera vez, valida sistemáticamente que los frotis residuales de médula ósea, incluso teñidos, sobrantes tras el diagnóstico de rutina, pueden servir como material inicial confiable para la detección de RM con alta sensibilidad. Esto aborda directamente las siguientes lagunas clínicas y metodológicas: (1) evita la necesidad de extraer grandes volúmenes de líquido de médula ósea para el monitoreo de RM, especialmente en pacientes ancianos o aquellos con dificultades para la toma de muestras; (2) permite el análisis retrospectivo de frotis archivados, aprovechando así los recursos patológicos existentes para establecer evidencia pronóstica basada en RM en cohortes históricas; y (3) con una sensibilidad de detección de 10^-5-10^-6, es muy superior a la MFC convencional (típicamente 10^-4-10^-5) y evita los falsos negativos causados por problemas de calidad de la muestra en la MFC, proporcionando una herramienta de evaluación de RM basada en ADN y rastreable para la práctica clínica.

Se identificaron varios pasos críticos para garantizar el éxito y la fiabilidad del ensayo. El raspado suave de los restos de frotis seguido inmediatamente por la aplicación del tampón fue esencial para obtener un rendimiento adecuado de ADN genómico. Se requirió una cantidad precisa de ADN de entrada (100 ng por reacción, dentro de ±10 %) para evitar la pérdida alélica o la amplificación sesgada. La agrupación equimolar de productos con códigos de barras (2 nM) contribuyó a una profundidad de secuenciación uniforme, y la aplicación constante de umbrales bioinformáticos (frecuencia clonal ≥10 % en el diagnóstico y ≤5 % de discrepancias para el seguimiento) ayudó a prevenir resultados falsos positivos en la detección de enfermedad residual mínima. Además, se introdujeron varias modificaciones al protocolo estándar para abordar problemas experimentales comunes. Cuando la concentración final de la biblioteca fue inferior a 5 nM, se añadió con precaución una segunda ronda de PCR con 2 a 4 ciclos adicionales para evitar el sesgo por sobre-amplificación. En muestras donde el seguimiento clonal falló debido a un exceso de discrepancias (>5 %), se actualizó la base de datos de referencia IMGT y se relajó temporalmente la tolerancia a discrepancias hasta un 8 % para análisis exploratorios, aunque el valor de corte estándar para informes clínicos permaneció en 5 %. Si la profundidad de secuenciación caía por debajo de 50 000 lecturas por muestra, se realizaba una nueva agrupación y resecuenciación sin repetir el paso de PCR.

En general, esta validación en condiciones reales demuestra que las muestras residuales de frotis de médula ósea producen resultados de prueba consistentes y confiables en diversos entornos terapéuticos. En áreas con desventajas económicas donde la biopsia de médula ósea y la citometría de flujo multiparamétrica (MFC) se realizan rutinariamente en lugar de la secuenciación de nueva generación (NGS), los hallazgos sugieren que la NGS puede considerarse para una evaluación molecular adicional cuando los resultados iniciales son negativos. El uso de muestras residuales es adecuado en tales situaciones, ya que elimina la necesidad de repetir la aspiración de médula ósea, reduciendo así la carga para el paciente.

Si bien nuestro estudio continuo en condiciones reales tiene como objetivo ampliar el tamaño de la muestra para un análisis más profundo, reconocemos varias limitaciones. Pueden ocurrir falsos negativos, particularmente cuando el contenido de ADN extraído es insuficiente, como se observó en la segunda detección de RM por NGS en el paciente 10. Además, la proporción de clones detectados mediante NGS se ve afectada por la cuantificación celular, lo que podría llevar a una sobreestimación de las proporciones de células con RM. La validación se centra principalmente en muestras de médula ósea. Sin embargo, la importancia a largo plazo de la RM por NGS radica en múltiples seguimientos posteriores al tratamiento, donde la sangre periférica podría ser más adecuada. Aún no se ha realizado la validación en muestras de sangre periférica. Dado el número limitado de muestras para validación clínica, el reclutamiento aleatorio de pacientes y los diversos enfoques terapéuticos en este estudio en condiciones reales, resultó difícil recolectar muestras consecutivas de RM. En consecuencia, nos centramos en evaluar la importancia de las respuestas tempranas de RM en relación con la progresión posterior, y no pudimos demostrar el impacto del estado persistente de RM en los resultados a largo plazo. Además, la NGF no se incluyó en el análisis comparativo. Aunque se compararon sistemáticamente la NGS y la MFC convencional, la NGF, como uno de los dos métodos de RM recomendados por el IMWG (el otro es la NGS), habría aportado información adicional sobre el desempeño del ensayo. Asimismo, el tamaño de la muestra es relativamente pequeño (n = 40) y la cohorte es heterogénea, incluyendo diversas malignidades hematológicas. Se requieren futuros estudios multicéntricos y a gran escala que incluyan la NGF y se centren en una única malignidad, como el mieloma múltiple, para confirmar y ampliar nuestras conclusiones.

Tras caracterizar y validar minuciosamente el rendimiento del ensayo de clonalidad de BCR/TCR basado en NGS, demostramos que tiene potencial como un método altamente sensible, preciso y práctico para cuantificar y monitorear la enfermedad residual mínima (MRD) en muestras de frotis de médula ósea residual de pacientes con mieloma múltiple (MM).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-CD19	Abcam	AB134114	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD20	Abcam	AB64088	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD22	Abcam	AB32123	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD33	Abcam	AB134115	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD34	Abcam	AB81289	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD38	Abcam	AB183326	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD45	Abcam	AB40763	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD56	Abcam	AB75813	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-CD9	Abcam	AB2215	Dilución según instrucciones del fabricante
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	Dilución según instrucciones del fabricante
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
Base de datos ImMunoGeneTics (IMGT)	Base de datos ImMunoGeneTics (IMGT)	http://www.imgt.org/
Líneas celulares de malignidades linfoides	ATCC	https://www.atcc.org/	Líneas de LLA-B REH y NALM6, línea de LLA-T Jurkat y línea de linfoma H9 (DSMZ)
Citometría de flujo multiparamétrica	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
Ensayo OriMIRACLE LTM	Origimed Co., Ltd., Shanghai, China
Lenguaje R	Foundation R para la Computación Estadística	versión 3.6.1