Comparación de los resultados del análisis de ADN espermatozoide utilizando diferentes estrategias de gating en citometría de flujo

Resumen

La compuerta poligonal (PGG) y la compuerta cruciforme (CFG) son métodos de citometría de flujo para detectar la integridad del ADN espermatozoide. PGG mide el índice de fragmentación del ADN (DFI) y el alto índice de tinción del ADN (HDS). CFG informa de DFI severo, DFI leve y DFI general. Este estudio tiene como objetivo comparar los resultados y las correlaciones entre ellos.

Resumen

La integridad del ADN espermática es un factor clave para garantizar la fecundación exitosa, el desarrollo embrionario y el embarazo continuo. La evaluación de la estructura de la cromatina espermática (SCSA) mediante citometría de flujo tras la desnaturalización del ADN y la tinción de naranja con acridina se considera el método de referencia para evaluar el ADN espermatozoide. En la literatura se han reportado dos estrategias de gating para la evaluación basada en citometría de flujo del índice de fragmentación del ADN espermatozoide (DFI): gating poligonal (PGG) y gating cruciforme (CFG). El objetivo del presente estudio fue comparar las relaciones de los resultados de los ensayos entre PGG y CFG, y analizar sus correlaciones con parámetros del análisis básico de semen. Los datos obtenidos de forma independiente mediante ambos métodos se compararon mediante análisis estadístico, incluyendo gráficos de Bland-Altman y análisis de regresión. Un total de 121 pacientes ambulatorios masculinos que se sometieron a una evaluación de fertilidad en el centro reproductivo de nuestro hospital fueron seleccionados mediante un método de muestreo completamente aleatorio. La DFI espermática y los indicadores relacionados fueron detectados mediante citometría de flujo utilizando PGG y CFG, respectivamente. Los resultados demostraron que los valores de DFI obtenidos de ambos métodos mostraron buena concordancia. Los coeficientes de correlación entre DFIp del método PGG y DFIm, DFIs y DFIc del método CFG fueron 0,6497, 0,9404 y 0,9667, respectivamente (todos p < 0,01). Un índice de coloración de ADN (HDS) alto mostró una ligera correlación negativa con los DFI (r = -0,3042, p < 0,05). El porcentaje de espermatozoides progresivamente móviles se correlacionó negativamente con DFIp, DFIs y DFIc (r = -0,3824, -0,3794, -0,3574, respectivamente, todos p < 0,05). No se observó correlación significativa entre el HDS y el volumen de semen, la concentración de espermatozoides, el recuento total de espermatozoides ni la PR (%). Estos hallazgos indican que los IFD están más estrechamente asociados con la fertilidad masculina, lo que sugiere que el método CFG, que proporciona este parámetro, podría ser más adecuado para la evaluación clínica del daño en el ADN espermatozoide.

Introducción

La integridad del ADN espermática se refiere a la integridad y estabilidad funcional de la estructura molecular del ADN en el núcleo del espermatozoide. Específicamente, se caracteriza por una conformación normal de la cromatina, secuencias de bases intactas sin rotura ni daño oxidativo, y la capacidad de transmitir con precisión información genética a la descendencia. Durante la espermatogénesis, cuando el estrés oxidativo aumenta¹, la remodelación de la cromatina es anormal², o el espermatozoide se ve afectado por toxinas^{ambientales 3}, la integridad del ADN espermatozoide se verá dañada, lo que resultará en desajustes de bases, pérdida, modificación, adición y reticulación de ADN, rupturas de cadena simple y doble, etc. Además, el ADN del esperma dañado puede afectar negativamente la fertilidad masculina y afectar negativamente los resultados del embarazo en la tecnología de reproducción asistida (ART⁾⁴, además de aumentar el riesgo de pérdida recurrente^{del embarazo 5}. En 2021, la Asociación Europea de Urología (EAU) recomendó la inclusión de las pruebas DFI en el sistema de evaluación de la fertilidad^{masculina 6}.

Actualmente, la integridad del ADN espermática se evalúa principalmente detectando el índice de fragmentación del ADN espermatozoide (DFI). El ensayo de estructura de la cromatina espermática (SCSA) mediante citometría de flujo es el método principal para evaluar^{DFI 7}. En la literatura se han reportado dos métodos de filtración por citometría de flujo para la detección de DFI en espermatozoides. Uno es el método de puerta poligonal (PGG), que puede informar simultáneamente de dos indicadores clave, como el DFI espermática y el HDS⁸. PGG es un enfoque clásico de SCSA caracterizado por un coeficiente de variación de detección menor y una repetibilidad^{superior 9}. Sin embargo, no puede distinguir la gravedad del daño en el ADN. Otro tipo es el método de gating cruciforme (CFG), que puede informar de marcadores de daño severos del ADN espermática (DFIs), marcadores de daño leve del ADN espermatozoide (DFIm) y el DFI total del método de gating cruciforme (DFIc). DFIc es igual a la suma de DFIs y DFIm. En comparación con las tecnologías actuales para evaluar la integridad del ADN espermatozoide, el método CFG puede reflejar la gravedad del daño al ADN^{espermatozoide 10}.

Para determinar qué método es más adecuado para evaluar la calidad del esperma, este estudio empleó tanto el método PGG como el método CFG para medir DFI y parámetros relacionados en espermatozoides. Se comparó la correlación entre los resultados de estos dos métodos y los parámetros convencionales de análisis de semen. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que analiza la correlación de los resultados de detección entre las dos metodologías, PGG y CFG.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Hospital Afiliado Huai'an First People Hospital de la Universidad Médica de Nankín (Número de aprobación: KY-2024-181-01). Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes cuyas muestras se utilizaron en este estudio. Diagrama esquemático general del flujo de trabajo presentado en la Figura 1. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se detallan en la Tabla de Materiales.

Ajustes de CFG para el citómetro de flujo
Tras el tratamiento ácido, la cromatina nuclear de los espermatozoides con ADN dañado muestra ADN monocatenario, mientras que la cromatina nuclear de los espermatozoides con ADN intacto conserva su estructura intacta de doble hebra. El colorante fluorescente acridina naranja (AO) se une al ADN monocatenario y emite fluorescencia roja cuando es excitado por un láser de 488 nm. Cuando se une a ADN de doble hebra, emite fluorescencia verde cuando es excitado por un láser de 488 nm. En función del número de señales fluorescentes rojas y verdes capturadas por el citómetro de flujo, se calcula la relación de la fluorescencia roja respecto al total de fluorescencia roja y verde, que representa el DFI del espermatozoide.

Los ajustes de la CFG se implementaron según la visión general proporcionada por Yang et ^al.10. El citómetro de flujo debe configurarse usando la fluorescencia verde más baja y la fluorescencia roja más alta medida en espermatozoides normales tintidos con O como referencias de límite (Figura 2). A continuación se muestra una lista de las características celulares de cada cuadrante del CFG:
El cuadrante Q1 indica esperma normal. Se observó que el ADN del esperma estaba intacto y que la cantidad de AO de unión era mínima, lo que resultaba en fluorescencia verde.
Los espermatozoides en el cuadrante Q2 tienen ADN parcialmente fragmentado y aparecen naranjas bajo microscopía de fluorescencia. Este ADN puede ser reparable, estos espermatozoides se clasifican como con fragmentación leve del ADN (DFIm⁾¹⁰.
El cuadrante Q3 se define como la fluorescencia inespecífica que ha sufrido resta.
Los espermatozoides en el cuadrante Q4 tienen ADN fragmentado y aparecen en rojo bajo microscopía de fluorescencia, lo que indica una fragmentación severa del ADN (DFI).

Se propone que los espermatozoides en los cuadrantes Q2 y Q4 contienen ADN fragmentado, y su suma se define como DFIc.

Ajustes del PGG para el citómetro de flujo
La compuerta poligonal para el análisis citométrico de flujo se estableció siguiendo el método descrito por Evenson et ^al.8. Como se muestra en la Figura 3, las características celulares asociadas a cada puerta son las siguientes:
P3 indica el porcentaje de células con ADN desnaturalizado.
P4 representa espermatozoides con alta colorabilidad del ADN (HDS). Este grupo de espermatozoides carece del intercambio normal entre histona y protamina.
Las poblaciones celulares predominantes situadas fuera de las compuertas P3 y P4 consisten en espermatozoides normales, que exhiben una fluorescencia roja reducida y emiten predominantemente fluorescencia verde.

Recogida y análisis de muestras de semen
Las 121 muestras de semen provenían de los hombres que visitaron el Centro Reproductivo del Primer Hospital de Huai'an afiliado a la Universidad Médica de Nankín. Se recogieron muestras de semen masturbándose tras un periodo de abstinencia de 2 a 7 días. El análisis rutinario del semen se realizó estrictamente conforme a los requisitos del Manual de Laboratorio de la OMS para el Examen y Procesamiento del Semen Humano^11,12. Los análisis de concentración y motilidad de espermatozoides se realizaron utilizando un sistema de análisis de esperma asistido por ordenador (CASA). Cada muestra fue analizada dos veces. Los resultados se informaron como media solo cuando la diferencia entre ambos resultados estaba dentro del intervalo de confianza del 95%; en caso contrario, se realizaron remuestreos y análisis.

Análisis de IFD
Calcular el volumen de muestra requerido para la muestra de semen de modo que la concentración final de espermatozoides en el reactivo A del kit de citometría de flujo sea de 2–3 x 10⁶/mL. Método de cálculo: Asumiendo que la concentración de esperma en la muestra original de semen es M x 10⁶/mL, entonces el volumen de semen requerido (μL) = 150/M. Añadir el volumen calculado de semen a un tubo de citómetro de flujo, luego añadir 50 μL de reactivo A y mezclar suavemente. Añade 100 μL de reactivo B, mezcla suavemente e incuba durante 30 s a temperatura ambiente. Añade inmediatamente 300 μL de reactivo C y mezclo suavemente. Detectar la muestra usando CFG y PGG en el citómetro de flujo y analizar al menos 5000 espermatozoides.

Análisis estadístico
Los datos fueron sometidos a análisis estadístico utilizando GraphPad Prism 6.0. Se construyeron parcelas de Bland-Altman para evaluar el nivel de concordancia entre PGG y CFG calculando la media y las diferencias. Las diferencias entre ambos métodos se representaron en función de sus valores medios. Además, se utilizó el método de Pearson para analizar la correlación entre PGG y CFG. Se determinó que un valor p inferior a 0,05 era estadísticamente significativo.

Resultados

Entre los 121 participantes del estudio (edad media: 32,5 ± 4,9 años; rango: 26–44 años), 28 fueron diagnosticados con astenozoospermia y 4 con oligozoospermia. Las características demográficas de referencia y los parámetros del análisis de semen se resumen en la Tabla 1.

Como se demuestra en la Figura 4, el gráfico de Bland-Altman reveló que los resultados DFI de espermatozoides obtenidos por los métodos PGG y CF...

Discusión

La sexta edición del Manual de Laboratorio de la OMS para el Examen y Procesamiento del Semen Humano¹² recomienda cuatro métodos para evaluar la integridad del ADN espermatozoide: marcaje terminal de desoxinucleotidil transferasa (dUTP), ensayos de electroforesis en gel unicelular (Comet), SCSA y prueba de dispersión de cromatina espermática (SCD). Entre ellas, SCSA ha sido ampliamente adoptado en laboratorios de andrología debido a su uso de citometría de flujo p...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sistema de análisis de esperma asistido por computadora	Beijing Suijia Software Co., Ltd	SA-II
Citómetro de flujo	Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd	Cyto E6
Kit de citometría de flujo	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD
Cámara de conteo Makler	Sefi Medical Instruments
Kit de integridad del ADN del núcleo espermático	Shenzhen BRED Biotechnology Co., LTD	-