Una plataforma digital de electroporación microfluídica para edición genómica CRISPR de baja entrada y transfección de ARNm en células T en suspensión y modelos de células 3D

Resumen

Este protocolo describe la edición miniaturizada del genoma CRISPR–Cas9 del receptor TCRα/β en células T humanas primarias utilizando 'DMF-ection', una plataforma de electroporación microfluídica digital (DMF). El método permite la edición genética paralela y de baja entrada y alta viabilidad y es además adaptable para la entrega de ARNm en esferoides 3D multicelulares.

Resumen

La electroporación microfluídica digital (DMF) permite una manipulación genética precisa y de bajo volumen de las células de mamíferos, minimizando la entrada celular hasta en 100 veces y preservando la viabilidad. Este estudio presenta un flujo de trabajo de transfección basado en DMF de alto rendimiento para la eliminación mediada por CRISPR del locus TRAC en células T de suspensión humana primaria y para la transfección de ARNm de esferoides HEK293T tridimensionales. Utilizando ARN guía CRISPR depositados espacialmente y ensamblaje de ribonucleoproteínas (RNP) en cartucho, se logró una alteración eficiente del locus TRAC tanto en poblaciones de células T CD4⁺ como CD8⁺ utilizando solo 10.000 células por condición, con viabilidades posteriores a la edición superiores al 85%. La caracterización biofísica mediante análisis inducidos por flujo y dispersión de Taylor reveló que los aditivos poliméricos estabilizan los complejos Cas9–sgRNA bajo condiciones de tampón de electroporación, apoyando la edición reproducible a volúmenes submicrolitros. El flujo de trabajo se adaptó aún más para aplicaciones 3D al introducir ARNm EGFP en esferoides intactos HEK293T, resultando en una fluorescencia robusta y espacialmente uniforme sin afectar el crecimiento o la morfología de los esferoides. En conjunto, estos resultados demuestran que la electroporación del DMF permite una edición eficiente del genoma y la entrega de ARNm tanto en células inmunitarias en suspensión como en esferoides multicelulares. Esta plataforma ofrece una solución escalable y de baja entrada para aplicaciones en terapia con células CAR-T, genómica funcional y modelos celulares 3D avanzados.

Introducción

La edición génica en células humanas primarias es cada vez más central tanto para el desarrollo terapéutico como para la investigación básica, incluyendo aplicaciones en inmunoingeniería, modelado de enfermedades raras y genómica^funcional. Aunque la electroporación permite una edición genómica altamente eficiente, los sistemas convencionales basados en cuvetas suelen requerir hasta millones de células por condición, lo que restringe su uso para muestras derivadas del paciente y poblaciones inmunitarias^{raras 2}. Además, estos sistemas son poco adecuados para el cribado a gran escala debido a limitaciones en el rendimiento de producción, automatización y consumo^{de reactivos 3}.

La electroporación microfluídica ha surgido como un enfoque prometedor para la edición genómica de baja entrada⁴. Sin embargo, la mayoría de las plataformas existentes dependen de arquitecturas de flujo continuo que implican un manejo complejo de fluidos, flexibilidad limitada en la mezcla de reactivos y requisitos relativamente altos de celda por condición. En cambio, la microfluídica digital (DMF) permite la manipulación activa de gotas discretas a escala de nanolitros en una matriz de electrodos planos, lo que permite un control preciso sobre la composición de la reacción, el tiempo y la localización espacial. Este formato plug-and-play basado en gotas es muy adecuado para flujos de trabajo de bajo volumen y alto rendimiento donde la conservación de las células primarias y reactivos es^{esencial 5}.

Trabajos recientes han demostrado la viabilidad de la entrega intracelular basada en DMF utilizando arquitecturas de electroporación tri-gotas que generan campos eléctricos localizados y de baja corriente para una entrega eficiente de RNP y ARNm, minimizando al mismo tiempo el estrés térmico y^{electroquímico 6,7,8}. Sobre esta base, se desarrolló una plataforma de electroporación DMF de próxima generación, denominada 'DMF-ection', que cuenta con 48 sitios de reacción direccionables de forma independiente, compatibilidad total de automatización y fabricación escalable^{de cartuchos 9} (Figura 1). El cartucho DMF consta de una placa inferior de la PCB y una placa superior de plástico separadas por una junta, ensambladas mediante broches de alineación en una única orientación correcta (Figura 1A). El diseño de 48 plexos está organizado en ocho familias idénticas (Figura 1A–H), cada una con seis sitios de electroporación direccionables de forma independiente, que soportan hasta 48 condiciones de edición paralela por cartucho (Figura 1B). Las bibliotecas de ARN guía se depositan sobre la superficie del sustrato mediante un dispensador acústico antes del ensamblaje del cartucho. Se confirmó la precisión posicional de la deposición en los 48 sitios, con posiciones de caída agrupadas dentro de una desviación submilimétrica respecto al punto medio del electrodo (Figura 1C), apoyando un ensamblaje fiable de RNP en el cartucho. Tras la carga, las celdas y las gotas de electrodo líquido se accionan en el cartucho para formar la geometría de electroporación de la triple gota (Figura 1D). Tras la electroporación, las células se descargan en placas de cultivo para su recuperación y análisis posteriores, incluyendo citometría de flujo, secuenciación y microscopía (Figura 1E). Este sistema permite una edición genómica de alta eficiencia utilizando hasta 100 veces menos células que los métodos estándar basados en cubetas, ampliando significativamente el acceso a la ingeniería genómica en aplicaciones de baja entrada y alto rendimiento.

Este estudio evalúa el rendimiento de la plataforma mediante la entrega de múltiples cargas biomoleculares, incluyendo complejos de ARNm y ribonucleoproteínas (RNP) CRISPR–Cas9, logrando una transfección eficiente y una alteración génica. Además de las células T primarias, la DMF-ection proporciona un marco generalizable para entregar ácidos nucleicos a estructuras multicelulares complejas. Los esferoides tridimensionales (3D) y los modelos de tipo organoide imponen barreras significativas a la penetración de los reactivos debido a su arquitectura y fragilidad, y los enfoques convencionales de electroporación a menudo alteran la morfología o generan una entrega heterogénea. Para evaluar si los mismos principios de electroporación miniaturizada usados para la edición de células T se extienden a tejidos estructurados, se aplicó el flujo de trabajo DMF a esferoides de HEK293T 3D. Estos experimentos demostraron que la electrohumectación basada en DMF puede posicionar suavemente esferoides intactos dentro de geometrías tri-gotas y soportar una entrega uniforme de ARNm mientras preserva la estructura y el crecimiento. Aunque estos resultados están fuera del protocolo principal de células T descrito aquí, ilustran la aplicabilidad más amplia de la electroporación programable de DMF para sistemas celulares 3D emergentes relevantes para el descubrimiento de fármacos y la modelización de enfermedades.

Protocolo

Las células T humanas primarias utilizadas en este protocolo se obtuvieron de proveedores comerciales bajo el consentimiento informado del donante y en cumplimiento de las directrices institucionales, éticas y regulatorias aplicables. Toda la manipulación de materiales biológicos de origen humano se realizó de acuerdo con los protocolos institucionales de bioseguridad. Los investigadores que implementan este protocolo son responsables de garantizar que su uso de células humanas primarias cumpla con los requisitos de la junta de revisión institucional local (IRB) o comité de ética, las normativas de bioseguridad aplicables y cualquier legislación nacional o regional relevante que regule el uso de material biológico humano. No se asoció información identificable por el paciente con el material celular utilizado en este estudio.

1. Preparación y activación de células T humanas primarias

1. La criopreservación rápida de células T CD3⁺ primarias humanas en un baño de agua a 37 °C. Transfiere las celdas a un medio basal de células T precalentado y centrifuga a 180 × g durante 10 minutos. Desecha el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en un medio fresco.
2. Determina la concentración y viabilidad celular usando un contador celular automático.
3. Resuspender células a 1 × 10⁶ células/mL en un medio de cultivo de células T suplementado con un anticuerpo tetramérico soluble para el activador de células T CD3/CD28 (según las instrucciones del fabricante) y 200 IU/mL de IL-2. Incubar células durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂.
   NOTA: Mantener la densidad celular entre 0,5–2 × 10⁶ células/mL durante la activación. Realizar activación en placas de 96 pozos en U-bottom para optimizar la eficiencia de contacto celda-activador y activación.

2. Preparación de manchas de ARN guía en el sustrato del DMF (spotting acústico por dispensador)

1. Reconstituir el ARNsg liofilizado en agua libre de nucleasas a una concentración de stock de 100 μM. En un tubo separado, prepare un stock de 100 mg/mL de ácido poli-L-glutámico (PGA, sal sódica, MW 15.000–50.000 Da) en agua libre de nucleasa. Combinar material de sgRNA y PGA en una proporción de volumen 5:4 (sgRNA: PGA) que produce una concentración final de sgRNA de 55,6 pmol/μL y una concentración final de PGA de 44,4 mg/mL en agua libre de nucleasa. Vortex brevemente y centrifugar a 1.000 × g durante 30 s y alicuotas en volúmenes de un solo uso, y almacenar alicuotas no utilizadas a −80 °C durante hasta 6 meses.
   NOTA: Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación.
2. Añadir la mezcla guía-PGA a una placa fuente acústica de bajo volumen muerto en pozos correspondientes al diseño deseado del sitio de reacción.
3. Transfiere 40 nL (equivalente a 2,2 pmol sgRNA) de la mezcla guía-PGA a cada región de detección objetivo del sustrato DMF usando un dispensador acústico calibrado.
   NOTA: A 55,6 pmol/μL, 40 nL suministra 2,2 pmol sgRNA por sitio (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Las guías secas se reconstituyen durante la fusión de gotas en el cartucho; La resuspensión completa se confirma mediante una eficiencia de edición constante entre los sitios.
4. En un armario de seguridad biológica, dejar que las gotas moteadas se sequen completamente al aire a temperatura ambiente hasta que no quede líquido visible (aproximadamente 5 minutos).
   NOTA: No utilice flujo de aire forzado ni calor, ya que esto podría desalojar o degradar el ARN guía.
5. Monta el cartucho DMF.
   1. En un armario de seguridad biológica, alinea la placa superior sobre el sustrato moteado haciendo coincidir las características asimétricas de plástico de la placa superior con las muescas de la placa inferior. Aplica una presión uniforme y simultánea a lo largo de los bordes cortos hasta que se sienta un chasquido mecánico distintivo, confirmando el acoplamiento total de las características de bloqueo.
      NOTA: El cartucho está diseñado con una única orientación correcta; un montaje incorrecto no producirá el chasquido. Sujeta los sustratos por los bordes en todo momento para evitar contaminaciones o daños en superficies funcionales y evita que los sustratos se deslicen entre sí, ya que esto podría rayar los recubrimientos superficiales.
   2. Punto de control: Confirma el montaje correcto mediante el chasquete mecánico.
      NOTA: No existe un indicador eléctrico previo de la integridad del recubrimiento; cualquier fallo funcional resultante de un ensamblaje incorrecto se detecta automáticamente y se reporta en el informe de control de calidad posterior a la ejecución.
      Punto de pausa: Guarda los cartuchos ensamblados sin usar en un paquete sellado con desecante (sobres de gel de sílice) a temperatura ambiente durante hasta 48 horas.

3. Preparación celular

1. Preparar 1 mL de tampón de transfección completo fresco antes de cada uso, combinando un tampón de electroporación compatible con DMF con el tensioactivo bioiónico no iónico proporcionado en una proporción 20:1 (v/v) (tampón de electroporación: tensioactivo), obteniendo una concentración final de tensioactivo del 0,05% (v/v). Mezcla suavemente y déjalo en hielo.
   NOTA: El buffer de transfección compatible con DMF utilizado aquí es un buffer isotónico de baja conductividad (conductividad: 3,5 mS/cm, osmolalidad: 305 mOsm/L). Los investigadores que utilicen buffers alternativos deben verificar la compatibilidad con la actuación del DMF y la viabilidad de las celdas. El tensioactivo no iónico biocompatible sirve para reducir la fijación de gotas; si no se utiliza el tensioactivo proporcionado, un sustituto adecuado.
2. Lava las células T activadas una vez con tampón de transfección (sin surfactante). Centrifugar a 180 × g durante 5 minutos, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet de celda en un tampón de transfección completa (que contiene tensioactivo) a 1,0 × 10⁷ células/mL en un volumen total de 100 μL por cartucho. Mantente en el hielo.
3. Inmediatamente antes de cargarla en el cartucho, añadir nucleasa Cas9 directamente a los 100 μL de suspensión de células T y mezclar pipeteando suavemente; Mantente en hielo.
   NOTA: Para las células T primarias, Cas9 se carga a 42 pmol por cada volumen de cartucho de 100 μL (0,42 pmol/μL). Cada sitio de electroporación procesa aproximadamente 1 μL de suspensión de celda, entregando 0,42 pmol Cas9 por edición. Optimiza esta dosis al adaptarte a otros tipos de células inmunitarias ( véase la Tabla 1).

Componente	Concentración final por edición
Cas9	0,42 pmol en ~1 μL de gota
sgRNA	2,1 PMOL (desde la posición de 40 NL)
PGA	44,4 mg/mL de fondo en mezcla para manchar
Tensioactivo	0,05% (v/v)
Entrada de celda	~10.000 celdas

Tabla 1: Tabla resumen de las concentraciones finales en cada gota de transfección.

4. Transfección en la plataforma de DMF-ección

1. Utilizando una pipeta multicanal, dispensa 10 μL de la mezcla T-célula/Cas9 en cada uno de los 8 puertos de carga de celdas, y 10 μL de buffer de transfección completo en los 16 conductos de carga de electrodos líquidos (como se muestra en la Figura 1).
2. Ajusta el voltaje a 500 V, la duración del pulso a 3 ms y el número de pulsos a 2. Inicia la secuencia de electroporación según las instrucciones de la plataforma.
   1. Punto de control: Revisa el informe de control de calidad post-carrera inmediatamente después de la carrera. Las fallas esporádicas (<10% de los sitios) no requieren intervención. Si los fallos son sistemáticos, sustituye el cartucho por la placa de control de calidad proporcionada, realiza la Revisión de Estado del Sistema (~2 min) y contacta con el soporte técnico si persisten los problemas.

5. Descarga y recuperación de células T editadas

1. Utilizando un manipulador de líquidos, transfiere las células electroporadas de cada sitio de reacción a una placa U-bottom de 96 pozos que contiene 150 μL de medio basal de células T precalentadas, suplementado con 200 IU/mL de IL-2.
2. Incubar células durante 72 horas a 37 °C, 5% de CO₂ para permitir la renovación proteica y cambios en la expresión de los receptores superficiales.

6. Análisis de citometría de flujo del knockout TRAC

1. Transfiere las células a una placa inferior cónica estéril de 96 pozos para reducir la pérdida celular entre lavados. Lava las células dos veces con Flow Cytometry Buffer (1× PBS, 2% FBS, 2 mM EDTA) centrifugando a 400 × g durante 5 minutos y retirando el sobrenadante invirtiendo suavemente la placa inferior cónica. Las células permanecerán en pellets dentro de la placa.
2. Preparar una mezcla maestra de tinción superficial que contenga anticuerpos anti-CD4, anti-CD8 y anti-TCRα/β en un tampón de citometría de flujo a las concentraciones recomendadas por el fabricante. Añade 25 μL de la mezcla maestra por pozo e incuba durante 20 minutos a 4 °C protegido de la luz. Lava dos veces con 1× PBS (sin FBS) centrifugando a 400 × g durante 5 minutos. Resuspender las células en 100 μL de 1× PBS que contenga un colorante de viabilidad a 1:1.000 (v/v) e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz.
   NOTA: Las placas inferiores cónicas son efectivas para esterilizar células; Comprueba que las células estén bien resuspendidas en todos los pasos.
3. Lavar las células dos veces con Flow Cytometry Buffer y resuspender en 150–200 μL por muestra para la adquisición.
4. Configura el citómetro con líneas láser y conjuntos de filtros apropiados para los fluorocromos utilizados (por ejemplo, excitación de 488 nm para tinte de viabilidad; 405 nm o 488 nm para marcadores superficiales según corresponda). Ajusta los voltajes usando controles de compensación de una sola mancha y una muestra sin teñir. Recoger un mínimo de 5.000 eventos en directo de singlets por muestra. Compuerta secuencial en: singletes de dispersión → células vivas (colorante de viabilidad negativo) → expresión CD4⁺ o CD8⁺ → TCRα/β.
   NOTA: Bajo condiciones estándar, el total de eventos vivos adquiridos puede variar entre 5.000 y más de 10.000 por muestra tras pérdidas durante el lavado y la tinción, dado que las células han tenido tiempo para proliferar.
5. Determinar la alteración del gen TRAC midiendo la frecuencia de células TCRα/β-negativas dentro de las poblaciones CD4⁺ y CD8⁺. Reporta la eficiencia de knockout como el porcentaje de celdas TCRα/β-negativas en relación con la puerta singlete viva para cada subconjunto.

Resultados

Resultados esperados
La electroporación de 10.000 células T activadas por condición suele resultar en una eficiencia de eliminación TRAC del >85% con una viabilidad del >95% 72 horas después de la transfección. La citometría de flujo revela una clara pérdida de tinción TCRα/β en la condición de dirección TRAC en comparación con controles de ARNsg (NTC) no dirigidos y controles no expuestos a campos eléctricos. Salvo que se indique lo contrario, n representa l...

Discusión

Este protocolo describe un flujo de trabajo miniaturizado de electroporación microfluídica digital que permite una entrega intracelular eficiente a las células T humanas primarias utilizando gotas a escala de nanolitros. Una ventaja central de este método es la capacidad de realizar edición genómica CRISPR–Cas9 utilizando solo 10.000 células por reacción, reduciendo drásticamente los requerimientos de material en comparación con la electroporación convencional. La arquitectura basada en ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentación
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Protocolo de esferoides
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Protocolo de esferoides
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 en 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentación
DMEM Media	Gibco	10564011	Suplementación de medios- cultivo de esferoides
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfección
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentación
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentación
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Suplementación de medios- cultivo de esferoides
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentación
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Protocolo de esferoides
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	Suplementación de medios para células T
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Sangre periférica, criopreservada, células T auxiliares pan CD3+, seleccionadas negativamente
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	Medio de activación de células T
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	Medio de activación de células T
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentación
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentación
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 en 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 en 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Suplementación de medios- cultivo de esferoides
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Uso a 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Protocolo de esferoides
Surfactant F	DropGenie		Transfección- uso a 1:20 en buffer compatible con DMF para hacer buffer de transfección completo
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Protocolo de esferoides