Protocolo para el seguimiento y cuantificación automática del comportamiento en Drosophila melanogaster

Resumen

Este protocolo utiliza la estimación de poses por Python para rastrear puntos clave del cuerpo en Drosophila emparejada, facilitando la cuantificación automatizada de comportamientos sociales sutiles, especialmente en la interacción social, así como mapas de calor y trayectorias locomotoras.

Resumen

Para desarrollar una herramienta analítica de código abierto que supere las limitaciones de los métodos tradicionales de seguimiento basados en centroides, presentamos un protocolo para analizar con precisión las interacciones sociales en parejas de Drosophila que se comportan libremente. Específicamente, este protocolo se inspira en el marco de redes de alta resolución (HRNet) para rastrear simultáneamente cinco puntos clave anatómicos —cabeza, tórax, abdomen y puntas de las alas izquierda y derecha— con el objetivo de generar datos de coordenadas de alta resolución para el análisis cuantitativo posterior de los comportamientos sociales. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo completo basado en Python y una interfaz gráfica de usuario (GUI) que diseñamos, incluyendo construcción de conjuntos de datos, entrenamiento de modelos y extracción automatizada de coordenadas, junto con módulos integrados para generar mapas de calor de ocupación espacial, trayectorias locomotoras y proporciones de interacción social en moscas. Para validar este marco, se probó utilizando dos cepas ampliamente utilizadas, w1118 y Canton-S (CS). Nuestros resultados demostraron la estabilidad de la detección de puntos clave y revelaron diferencias específicas del genotipo en la utilización espacial y la estructura de la locomotora. Esta metodología proporciona una base escalable para la etología cuantitativa y el análisis automatizado de las interacciones sociales en Drosophila, al tiempo que reduce el esfuerzo de anotación manual y mejora la reproducibilidad.

Introducción

Drosophila melanogaster es un organismo modelo ampliamente utilizado con potentes herramientas genéticas y circuitos neuronales bien mapeados que permiten la disección mecanicista del comportamiento¹. Tiene una amplia gama de comportamientos sociales, incluyendo cortejo y agresión, y una fuerte capacidad de aprendizaje 2,3,4,5,6,7,8. Cada uno está compuesto por elementos motores distintos controlados por un sistema nervioso compacto pero extremadamente bien organizado. Es importante destacar que la medición precisa de la postura corporal es esencial para comprender los fundamentos neurológicos de la selección de acciones, ya que muchos de estos comportamientos contienen motivos posturales finos que codifican información contextual e interna ^9,10.

A pesar de la necesidad de resolución de una sola mosca para capturar diferencias individuales, muchos ensayos conductuales de alto rendimiento en Drosophila aún dependen de índices a nivel^{de grupo 11}. Los ensayos conductuales de alto rendimiento incluyen pruebas T-maze para preferencia^{social 12,13}, ensayos de espaciamiento social que cuantifican la distancia entre moscas, o paradigmas de agregación/evitación bajo estimulación sensorial¹⁴ que pueden capturar eficientemente tendencias poblacionales. Sin embargo, implican inherentemente promediar entre individuos, oscureciendo así la heterogeneidad en las secuencias de acción y la estructura temporal de los intercambios sociales. A lo largo de los años, los intentos de avanzar hacia la identificación por mosca se han basado en métodos funcionalmente restringidos, como la detección de eventos basada en reglas usando umbrales cinemáticos, la resta de fondo con seguimiento de centroides y la anotación manual^{de vídeo 15, 16, 17, 18}. Como resultado, comportamientos discretos como lanzarse, golpetear o amenazas en las alas a menudo se ignoran o etiquetan erróneamente, lo que requiere una corrección manual significativa. Estas limitaciones han restringido los estudios mecanicistas que requieren una alineación temporal precisa entre la actividad neuronal y las acciones individuales.

Ahora existe una solución revolucionaria gracias a los recientes avances en visión por ordenador y estimación de poses basada en aprendizaje automático. Frameworks de código abierto como DeepLabCut¹⁹ y SLEAP²⁰ permiten la detección de partes del cuerpo sin marcadores, la clasificación escalable de acciones discretas y la preservación de la identidad individual incluso durante interacciones cercanas. Estas características superan las desventajas de enfoques previos basados en grupos y reglas y permiten una cuantificación repetible de comportamientos sociales complejos.

Las interacciones individuales en Drosophila se caracterizan por características motoras únicas que indican la progresión de las interacciones sociales. La agresión, por ejemplo, incluye comportamientos típicos como lanzarse, amenazas de alas y agarrar, todos ellos representando etapas de conflicto^{crecientes 21,22}. El cortejo se define de manera similar por la orientación, la extensión unilateral de las alas con la producción de canto, el golpeteo e intento de cópula, que se unen para formar la secuencia temporal de interacciones^{de apareamiento 23}. Capturar estos motivos depende del reconocimiento preciso de la postura corporal y los movimientos^{articulares 24,25}. En la práctica, el muestreo requiere una alta resolución espacial y temporal durante periodos prolongados de registro para asegurar que patrones motores sutiles puedan detectarse y alinearse con precisión con la actividad^{neuronal 25,26}.

Aquí presentamos un marco de código abierto basado en la visión para la identificación automatizada de cinco puntos anatómicos clave: cabeza, tórax, abdomen, puntas del ala izquierda y^{derecha 27}. El sistema comprende un flujo de trabajo completo para la construcción de conjuntos de datos, entrenamiento de modelos y extracción de coordenadas, y genera datos de series temporales de alta resolución adecuados para una clasificación conductual personalizable. Al automatizar los procesos de anotación manual y estandarizar los flujos de trabajo analíticos, nuestro método permite un análisis cuantitativo a gran escala de los comportamientos de interacción social, aumentando la eficiencia y la reproducibilidad mientras reduce significativamente el tiempo y la mano de obra necesarios para el análisis.

Para validar la fiabilidad del sistema, lo aplicamos a dos cepas de laboratorio comúnmente utilizadas, w1118 y Canton-S (CS), y observamos una detección estable de puntos clave a través de los marcos, así como diferencias específicas de genotipo en ocupación espacial, características de trayectoria e indicadores de interacción social basados en la distancia de la cabeza y el ángulo de orientación. Los investigadores pueden evaluar la idoneidad de este protocolo basándose en la resolución espaciotemporal requerida (≥30 fps, ≤0,5 mm/píxel) y las condiciones de grabación de vídeo (iluminación y contraste). El tamaño del píxel se puede determinar directamente a partir de la configuración de la cámara. Una mosca de la fruta con una longitud corporal medida puede colocarse dentro del campo de visión de imagen para su calibración. Este protocolo es especialmente adecuado para los siguientes escenarios: la necesidad de rastrear simultáneamente a dos Drosophilas que interactúan libremente y distinguir sus identidades individuales; centrándose en posturas finas (por ejemplo, ángulo y distancia de cabeza) en lugar de solo en las posiciones del centroide; la duración de la grabación superior a 10 minutos cuando la anotación manual no es factible; requiriendo una alineación temporal a nivel de milisegundos entre eventos conductuales y actividad neuronal (por ejemplo, imágenes de calcio o electrofisiología) en análisis posteriores.

Protocolo

1. Preparación de la mosca

1. Recoge y seadora las moscas de unos 3–4 días bajo breve anestesia de CO₂ antes de los experimentos.
   NOTA: La duración de la anestesia y el caudal de CO₂ pueden variar según las especificaciones y la presión del cilindro de dióxido de carbono utilizado en cada laboratorio. Las moscas deben ser monitorizadas continuamente durante la anestesia, y la exposición al CO₂ debe mantenerse solo hasta que estén completamente anestesiadas y muestren una suspensión total de movimiento.
2. Coloque cada mosca individualmente en un tubo Falcon de 50 mL que contiene un medio estándar de harina de maíz, agar, glucosa y levadura.
3. Mantener las moscas a 25 °C bajo un ciclo de 12 horas luz/oscuridad hasta su uso.

2. Construcción de la arena

1. Prepara dos placas acrílicas transparentes de 3 mm y una de polietileno de 3 mm.
2. Corta cuatro cámaras circulares (de 35 mm de diámetro cada una) en el centro de la placa de polietileno.
3. Utiliza clips para unir una placa de acrílico a la placa de polietileno y formar la base de la cámara; Guarda la segunda placa de acrílico como tapa extraíble.

Figura 1: Esquema del ámbito conductual y configuración de imágenes. (A) La construcción de una cámara de observación personalizada se representa en el diagrama. La cámara consta de tres capas principales: una base de acrílico transparente de 3 mm; una placa de polietileno de 3 mm con cuatro recortes circulares de 35 mm de diámetro que servían como pozos individuales de cámara; y una segunda placa de acrílico que funciona como tapa extraíble. (B) Se utiliza una abrazadera adaptadora de 90° para instalar la cámara verticalmente sobre un poste óptico de 40 cm. Para la imagen de arriba hacia abajo, la cámara se posiciona directamente sobre la arena de observación multicapa con su eje óptico perpendicular a la superficie de la cámara. Por favor, haz clic aquí para ver una versión ampliada de esta figura.

3. Montaje de imágenes

1. Montar dos postes ópticos de 20 cm y uno de 40 cm con abrazaderas adaptadoras de 90°.
2. Monta la cámara (1280 × 1024 píxeles) verticalmente sobre el poste de 40 cm, alineada perpendicularmente a la superficie de la arena, y ajusta la tasa de fotogramas a 150 fps.
3. Coloca la arena sobre un panel LED regulable de 25 cm × 25 cm de color blanco diurno cubierto con una lámina de difusión.
4. Ajusta la iluminación a unos 1500 lux en la superficie de la arena.
   NOTA: Asegúrese de que los bordes de las alas permanezcan visibles en la vista previa binaria. Evita >2000 lux para evitar artefactos inducidos por el calor, ya que las moscas pueden cambiar su locomoción o distribución natural debido al estrés térmico de la fuente de luz.

4. Procedimiento de registro

1. Coloca almohadillas de espuma de 3 cm bajo cada esquina de la arena para estabilizarla.
2. Transfiere pares de moscas bajo anestesia CO₂ a las cámaras; Sella con la placa acrílica superior.
3. Deja que las moscas se aclimaten durante 40 minutos antes de grabar.
4. Inicia la adquisición de vídeo usando MIAS.exe²⁷: pulsa q para comenzar y c para parar.
   NOTA: Esto da lugar a grabaciones de vídeo continuas de parejas de moscas interactuando libremente bajo condiciones estandarizadas.

5. Definir el panel de actividades sociales

1. Ejecuta el script de preprocesamiento: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   NOTA: Todos los scripts de codificación se proporcionan en el Archivo Suplementario 1.
2. Anota el área de la cámara y asigna metadatos en forma de Genotype_age (días) × 1 (número de cámaras). (por ejemplo, CS_3 × 1)
3. Ajusta el deslizador del umbral de detección hasta que las alas sean casi invisibles en la imagen binaria para asegurar una subtracción óptima del fondo y visibilidad de las alas.

6. Preparación del conjunto de datos

1. Crea una nueva carpeta de conjunto de datos ejecutando:
   Herramientas de python/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (intervalo de muestreo de tramas)
   NOTA: El parámetro de intervalo de muestreo de tramas ("10") fue adaptado de un protocolo²⁷ previamente publicado. Valores más bajos aumentan la densidad de muestreo y la carga computacional, mientras que valores más altos reducen la demanda computacional y pueden ajustarse en función del rendimiento disponible del hardware y los requisitos experimentales.
2. Configura la ruta de vídeo y la ruta del conjunto de datos en 'herramientas/SoAL_DatasetUtils.py'.
3. Interfaz de etiquetado manual de lanzamiento:
   >herramientas de python/SoAL_LabelUI.py NOMBRE DE DATOS
   1. Navegación por fotogramas: Pulsa la tecla Espacio o la tecla Z para navegar al siguiente o al anterior, respectivamente. Alternativamente, usa el deslizador de línea temporal para navegar.
   2. Etiquetado de puntos clave: Haz clic en la posición correcta de una mosca en cada imagen (en una secuencia específica: cabeza, tórax, abdomen, ala izquierda y ala derecha) para marcar los 5 puntos clave.
   3. Selección de puntos clave: Pulsa las teclas numéricas para seleccionar un punto clave (indicado por un círculo blanco). El siguiente clic reasignará un nuevo número al punto clave seleccionado.
   4. Guardar: Cierra la ventana o pulsa la tecla D para guardar los resultados de la anotación.
      NOTA: Un archivo completo de conjunto de entrenamiento consta de dos componentes: un directorio de imágenes y un archivo annotation.json.

7. Entrenamiento con modelos

1. Divide el conjunto de datos en conjuntos de entrenamiento y validación:
   Herramientas de Python/SoAL_DatasetGen.py División de nombres de DATASET
   Se crearán dos carpetas nuevas en 'dataset/.'
2. Configurar parámetros de entrenamiento en hrnet/fly_w32.yaml:
   Factor de rotación: 15°
   Factor de escala: 0,35
   Factor de brillo: 0,25
   Tamaño del lote: 24
   Épocas: 200
3. Realiza el programa de formación:
   Python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Terminar los conjuntos de entrenamiento cuando la precisión media (AP) se estanca; retener el mejor modelo (AP > 90%).
4. Validar el modelo usando:
   Python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Resultado: Modelo robusto basado en HRNet para la detección de puntos clave con múltiples vuelos.

8. Ejecutar el programa de detección

1. Copia los archivos de vídeo nuevos en el directorio de vídeo.
2. Anota los metadatos como se muestra en el paso 5.
3. Ejecutar programa de detección: python SoAL_KptDetect.py todo
4. Inspeccionar los resultados de la detección:
   Herramientas/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path de Python (.CVS/XSLX)
   Resultado: Coordenadas bidimensionales de cinco hitos anatómicos por mosca a través de los marcos.

9. Cuantificación conductual

1. Inicia una aplicación GUI independiente para análisis (Archivo Suplementario 2) e importa archivos de coordenadas en la interfaz.
2. Genera mapas de calor de ocupación espacial (densidad de probabilidad de posiciones en la arena).
3. Reconstruir trayectorias locomotoras a partir de series temporales de coordenadas.
4. Crea datos de interacción social, incluyendo la distancia de la cabeza, la orientación y el estado social derivado.
   Resultado: Visualización estandarizada del uso espacial específico del genotipo y la dinámica del movimiento.

Resultados

La Figura 1 ilustra la geometría de la arena, la configuración de iluminación y la colocación de la cámara utilizadas para registrar las interacciones sociales naturales en Drosophila. El montaje garantiza una iluminación uniforme y condiciones de imagen estables, adecuadas para la estimación de poses y la extracción de coordenadas.

Se aplicó estimación automática de poses a todos los vídeos grabados para extraer coordena...

Discusión

Nuestro estudio muestra que la estimación de postura basada en aprendizaje automático proporciona un método escalable y fiable para medir interacciones sociales detalladas en Drosophila. Supera las limitaciones de los enfoques basados en^centroides 15,16,17,18 siguiendo cinco puntos clave anatómicos en pares que interactúan libremente, permitiendo la adquisición de información angular proporcionada por el eje corporal y la distancia cabeza a cab...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	BioFroxx	8211GR500
cámara(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Dióxido de Carbono	Messer	124-38-9
D(+)-Glucosa anhidra	BioFroxx	1179GR500
Viales Estrechos Drosophila (tubo Falcon)	Biolgix	51-0500
Etanol	Chron Chemicals	64-17-5
Panel LED	/	/	hecho a medida
Metilparabeno	Sigma	99-76-3
placa de polietileno	/	/	hecho a medida
Python	/	versión 3.6
Sacarosa	DaMao	57-50-1
placas de acrílico transparente	/	/	hecho a medida
Levadura	Angel	100004237033