Cribado de alto rendimiento de mutantes de Bacillus coagulans hiperproductores de ácido L-láctico utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas

Resumen

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estándar de cribado de alto rendimiento para microorganismos industriales. Consiste en construir una biblioteca mutante mediante mutagénesis ARTP, realizar cribado positivo de gotas con microfluidica automatizada y, posteriormente, verificar los resultados. La fiabilidad del flujo de trabajo se validó mediante el cribado de cepas de B. coagulans de alto rendimiento.

Resumen

La biofabricación industrial depende de microorganismos para sintetizar eficientemente productos objetivo bajo condiciones diseñadas. Sin embargo, las cepas de tipo salvaje a menudo carecen de la capacidad para hacerlo debido a sus redes metabólicas nativas. Por lo tanto, el cribado rápido y preciso de cepas de alto rendimiento a partir de bibliotecas mutantes a gran escala es un paso fundamental en la mejora microbiana industrial. En los últimos años, la tecnología microfluídica de gotas ha atraído una atención significativa por su alto rendimiento, bajo consumo y capacidad de compartimentación de células individuales, lo que ha llevado al desarrollo de numerosos sistemas de clasificación de célula única. En este estudio se presenta un protocolo de cribado de alto rendimiento para cepas microbianas industriales utilizando una plataforma microfluídica automatizada de gotas. El flujo de trabajo integrado comprende cuatro etapas clave: construcción de una biblioteca mutante mediante mutagénesis de plasma atmosférico y a temperatura ambiente (ARTP); encapsulación unicelular de alta eficiencia y microcultivo controlado dentro de gotas a escala de picolitro; pico-inyección precisa de un biosensor fluorescente, seguida de la clasificación de gotas activada por fluorescencia (FADS) para aislar gotas que contienen variantes de alta producción; y la validación de las cepas candidatas clasificadas mediante fermentación en microplacas y matrazas agitadas. Un flujo de trabajo de cribado completo e integrado está pensado como plantilla estandarizada, y su validación se demuestra mediante el aislamiento de mutantes productores de ácido L-láctico de alto rendimiento de B. coagulans como ejemplo específico. Esta plataforma automatizada y de alto rendimiento ofrece una solución técnica potente con un potencial significativo para acelerar la mejora industrial de cepas de alto rendimiento en la producción.

Introducción

La biotecnología industrial utiliza microorganismos y enzimas como biocatalizadores para producir productos valiosos a gran escala. Este enfoque se considera más respetuoso con el medio ambiente y eficiente que la fabricación química tradicional. Sin embargo, las redes metabólicas naturales de los microorganismos han evolucionado para priorizar su propia supervivencia y reproducción en lugar de la síntesis eficiente de productos deseados por los humanos. Como resultado, la mejora microbiana de alto rendimiento suele ser necesaria para satisfacer las demandas de entornos industriales de producción con condiciones^{estrictas 1,2,3}. Este proceso implica construir rápidamente bibliotecas microbianas mutantes a gran escala mediante mutagénesis física o química, seguida de cultivo y detección fenotípica de mutantes con genotipos distintos. Solo se selecciona una pequeña fracción de cepas superiores. Sin embargo, las tecnologías tradicionales de cribado basadas en placas y microplacas se ven obstaculizadas por procedimientos engorrosos, bajo rendimiento y alto coste. Este cuello de botella, junto con el consumo significativo de consumibles y reactivos, resulta en una baja eficiencia global de la mejora^{microbiana 4,5}.

La microfluídica de gotas ha surgido recientemente como una solución transformadora a este desafío. A diferencia de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), que no es adecuada para el cribado de productos secretados debido a la rápida difusión de moléculas fuera de la célula, la clasificación de gotas activada por fluorescencia (FADS) encapsula células individuales en microreactores compartimentados a escala^{de picolitro 6,7,8}. Este aislamiento físico previene la competencia de la cefa, permite la acumulación localizada de metabolitos secretados y facilita su detección cuantitativa mediante biosensores fluorescentes. En consecuencia, el FADS ha demostrado ser una plataforma ideal para el cribado de alto rendimiento de diversos productos extracelulares, incluidos aminoácidos, ácidos orgánicos y enzimas. Un equipo desarrolló el biosensor fluorescente codificado genéticamente GECFINDER y, combinado con FADS, lograron detectar cepas de alta producción de fenilalanina y mejorar la eficiencia del cribado en más de 1000 veces⁹. Otro grupo estableció una plataforma de selección de gotas activada por fluorescencia acoplada a un biosensor codificado genéticamente para el cribado de alto rendimiento de cepas productoras de ácido 3-deshidroshiquímico en E. coli, y el sistema FADS optimizado mejoró considerablemente la eficiencia del cribado y permitió el aislamiento de cepas mutantes con una producción significativamente^{mejorada 10}. Algunos investigadores aplicaron la tecnología FADS a la ingeniería de la ADN polimerasa Bst, y los mutantes adquiridos con una gran mejora en la termorstabilidad y la actividad de desplazamiento de la cadena se aplicaron además a la detección LAMP, lo que redujo el tiempo de reacción de 40 minutos a 10 minutos¹¹.

Sin embargo, la traducción de estos avances tecnológicos en flujos de trabajo rutinarios de desarrollo de deformación industrial sigue siendo un reto. Muchos sistemas microfluídicos comerciales de gotas, a pesar de su hardware sofisticado, carecen de un procedimiento operativo estándar completo, intuitivo y reproducible adaptado al cribado fenotípico microbiano. Para cubrir esta carencia, se adoptó una plataforma microfluídica automatizada de gotas que integraba control fluido modular, software fácil de usar y diseño estandarizado de chips, sentando una base técnica ideal para el establecimiento de un flujo de trabajo de cribado totalmente integrado. Este estudio utiliza el cribado de alto rendimiento de B. coagulans productores de ácido L-láctico de alto rendimiento como caso de validación. Basado en una plataforma microfluídica de gotas, se estableció el siguiente flujo de trabajo, que comprende cuatro pasos secuenciales clave: (1) construcción de una biblioteca mutante diversa mediante mutagénesis de plasma atmosférico y a temperatura ambiente (ARTP); (2) encapsulación unicelular de alta eficiencia y microcultivo controlado dentro de gotas bajo condiciones optimizadas para el crecimiento de B. coagulans y la producción de ácido L-láctico; (3) pico-inyección precisa de un biosensor fluorescente específico para L-lactato, seguida de una selección rápida de gotas que encapsulan a productores superiores; y (4) validación rigurosa de los candidatos clasificados mediante fermentación por matraz agitado para confirmar una mayor producción y estabilidad genética. Este protocolo está destinado a investigadores e ingenieros dedicados a la mejora microbiana industrial que requieren un cribado de alto rendimiento de productos extracelulares. Es especialmente adecuado para bacterias cultivables que secretan metabolitos o enzimas de pequeñas moléculas. La plataforma de cribado debe estar equipada con sensores compatibles con el microentorno de gotas para permitir la detección específica de los metabolitos objetivo. Para cepas con requisitos de cultivo especiales (por ejemplo, anaerobios estrictos), los parámetros de cultivo pueden adaptarse para optimizar y establecer una estrategia de cultivo dedicada. Al establecer este flujo de trabajo de cribado estandarizado y en bucle cerrado, este estudio pretende proporcionar una solución potente y transferible para acelerar la mejora industrial de cepas.

Protocolo

No se requería aprobación ética para este estudio. Todos los experimentos se realizaron utilizando cultivos microbianos puros, y no participaron sujetos humanos ni animales de laboratorio en esta investigación. Consulte la Tabla de Materiales para detalles sobre todos los materiales utilizados en el siguiente protocolo.

1. Preparativos

PRECAUCIÓN: Sigue las prácticas de bioseguridad. B. coagulans es un organismo de Bioseguridad Nivel 1. Lleva guantes y bata de laboratorio. Realiza todas las manipulaciones abiertas dentro de una campana de flujo laminar. Autoclave de todos los materiales que entren en contacto con células vivas a 121 °C durante 20 minutos antes de su eliminación.

1. Fuente de deformación y mantenimiento
   1. Compra B. coagulans ATCC 7050 en un centro comercial de recogida de cultivos como cultivo inclinado de segunda generación.
   2. Estirar una parte del cultivo inclinado sobre el agar del medio de semilla e incubar a 50 °C durante 24 horas. Elige una sola colonia, inocúlala en medio líquido para semilla y cultiva a 50 °C, 200 rpm durante 12 horas.
   3. Mezclar el cultivo resultante con glicerol estéril al 40% hasta una concentración final del 25% (v/v) y almacenarlo como caldo congelado a –80 °C. Para cada experimento, descongela una alicuota fresca, la estiras sobre el agar del medio semilla y incuba a 50 °C durante 24 horas.
   4. Luego se elige una sola colonia, se inoculara en medio líquido para semilla y se cultiva a 50 °C, 200 rpm durante 12 horas antes de usarla para mutagénesis y cribado (Figura suplementaria 1).
2. Sensor de ácido láctico
   1. Expresa y purifica el sensor eLACCO1.1 tal y como se describe en los Materiales^{Suplementarios 12} (Figura Suplementaria 2).
   2. Suplementa el sensor purificado con glicerol al 5% (v/v) y guárdalo a –80 °C. Para cada experimento, descongela una alicuota sobre hielo y dilúyela inmediatamente con 10 mM PBS estéril (pH 7,4) hasta una concentración final de trabajo de 0,1 mg/mL.
3. Preparación de medios culturales
   1. Medio semilla (g/L: glucosa 20, extracto de levadura 5, triptona 10, acetato sódico 2, citrato de sodio 2, K₂HPO₄ 2, MgSO_{4,7H 2}O 0,2, MnSO₄· H₂O 0,05, FeSO 4,7H₂O 0,01). Esteriliza la glucosa por separado como un fondo de 200 g/L a 115 °C durante 20 minutos.
      1. Autoclave de los componentes restantes a 121 °C durante 15 minutos. Tras enfriar, añade un stock de glucosa estéril a una concentración final de 20 g/L y luego filtra y esteriliza los oligoelementos.
      2. Conserva el medio completo a 4 °C durante hasta una semana. Úsalo para activación nocturna, preparación de inóculos.
   2. Medio de cribado (g/L: glucosa 20, extracto de levadura 6,66, NaCl 0,333, NH₄Cl 0,665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4,46, MgSO₄ 0,12, CaCl₂ 0,074).
      1. Esteriliza la glucosa por separado a 115 °C durante 20 minutos. Autoclave la mezcla de sal y extracto de levadura a 121 °C durante 15 minutos.
      2. Tras enfriar, añade el fondo de glucosa estéril a 20 g/L. Conserva a 4 °C durante hasta una semana. Utilizarse como fase acuosa para la generación de gotas y como medio de cultivo dentro de gotas durante las 10 horas de incubación.
   3. Medio de fermentación (g/L: glucosa 90, triptona 13,33, extracto de levadura 13,33, acetato de sodio 0,67, NaCl 0,0133, MgSO_4,7H₂O 0,0133, MnSO₄· H₂O 0,0133, FeSO 4,7H ₂O 0,0133).
      1. Esteriliza la glucosa en un caldo de 500 g/L a 115 °C durante 20 minutos. Autoclave de los demás componentes a 121 °C durante 15 minutos.
      2. Tras enfriar, añade el stock de glucosa estéril a 90 g/L. Añade polvo de CaCO₃ estéril (4% en pa/v) justo antes de la inoculación para amortiguar el pH. Prepárate fresco cada día. Úsalo para el cribado primario de microplacas y la validación de matrazs agitados.
         NOTA: Prepara todos los medios con agua destilada hasta un volumen final de 1 L. Ajusta el pH a 6,5 con 1 M HCl.

2. Construcción de una biblioteca mutante usando ARTP

PRECAUCIÓN: El funcionamiento de ARTP implica un plasma de alta frecuencia y una lámpara UV. La radiación UV puede causar lesiones en ojos y piel. La descarga de plasma genera ozono y altas temperaturas. Mantén siempre la puerta de la cámara cerrada mientras el plasma está encendido. Lleva bata de laboratorio y gafas que bloqueen UV. Usar solo un 99,999% de helio puro; Asegura una ventilación adecuada. Tras cada operación de mutagénesis, limpia el banco de trabajo y las paredes internas de la cámara de mutagénesis con un paño sin pelusa sumergido en etanol al 75% (v/v). El etanol al 75% es altamente inflamable. Mantente alejado de llamas abiertas, chispas y superficies calientes.

1. Establecer una curva estándar que correlacione el OD₆₀₀ con la concentración celular viable.
   1. Inocular una sola colonia de B. coagulans en un medio semilla e incubar a 50 °C, 200 rpm durante 12 horas hasta que el cultivo alcance la fase logarítmica media.
   2. Prepara diluciones en serie de la suspensión bacteriana en gradientes de 10⁴, 10⁵ y 10⁶.
   3. Pipetear 100 μL de cada dilución y extender uniformemente sobre las placas de agar del medio semilla en triplicado.
   4. Incubar todas las placas de agar chapadas a 50 °C durante 24 horas.
   5. Cuenta las unidades formadoras de colonias (UFC) para cada dilución.
      NOTA: La calibración muestra que_{OD 600} = 0,5 corresponde aproximadamente a 1 × 10⁸ UFC/mL. Utilice esta relación para determinar la densidad celular inicial para la encapsulación de gotas (Figura suplementaria 3).
2. Cultivar B. coagulans hasta la fase logarítmica media a tardía, luego diluir el cultivo de semillas frescas a OD₆₀₀ = 0,05 en medio fresco de semilla.
3. Dentro de una campana laminar, prepare ocho discos metálicos pequeños estériles y un disco metálico grande. Quema los ocho discos pequeños sobre un fuego de alcohol durante 1 minuto, colócalos sobre el disco grande estéril y déjalos enfriar durante 10 minutos.
4. Utilizando una micropipeta, se distribuyen uniformemente 10 μL de la suspensión bacteriana diluida sobre cada uno de los ocho discos pequeños enfriados.
5. Transfiere el disco grande que contiene los pequeños discos inoculados a una placa de Petri estéril.
6. Enciende el instrumento ARTP y activa la pantalla de control principal. Enciende la lámpara UV dentro de la cámara de mutagénesis. Enciende el enfriador y enfría previamente durante 20 minutos hasta que la temperatura se estabilice en 20 °C.
7. Abre rápidamente la puerta de la cámara de mutagénesis y coloca los pequeños discos dentro.
8. Utilizando pinzas estériles, transfiere secuencialmente cada pequeño disco a la etapa de muestra ARTP.
   NOTA: La potencia RF, el caudal de gas helio, la distancia tobera-muestra y la pureza del helio se fijaron en 120 W, 10 SLM, 2 mm y 99,999%, respectivamente. El tiempo de irradiación de helio se estableció en 5, 10, 15, 20, 25 y 30 s, respectivamente.
9. Someter cada pequeño disco a mutagénesis ARTP según los parámetros establecidos. Tras la irradiación, transfiere todos los discos a un tubo centrífugo de 50 mL que contenga 10 mL de medio de recuperación. Incubar a 50 °C con agitación a 200 rpm durante 4 horas para permitir la recuperación y crecimiento celular.
10. Determinación de la tasa de letalidad.
    1. Diluir en serie el cultivo recuperado a un gradiente de ^10-2 a ^10-6.
    2. Esparce 100 μL de cada dilución sobre placas de agar del medio semilla y prepara tres réplicas para cada dilución.
    3. Incuba todas las placas a 50 °C durante 24 horas.
    4. Cuenta las colonias y calcula la CFU/mL correspondiente.
    5. Calcula la tasa de letalidad usando la fórmula:
       (1)
       NOTA: Realiza el experimento en triplicado para cada punto temporal. El tiempo óptimo de mutagénesis para ARTP en este caso es de 20 s (Figura suplementaria 4).

3. Composición de la plataforma microfluídica automatizada de gotas y consumibles

1. Sistema de actuación (Figura 1)
   NOTA: Consta de 3 canales de controladores de presión de alta precisión con un rango de presión de 0 a 1000 mbar y un tiempo de respuesta a presión de < 50 ms (Figura 1A).
2. Sistema de imagen
   NOTA: La imagen microscópica CMOS de alta velocidad cuenta con adquisición de datos de imagen a alta velocidad de ≥ 2 GB/s, una tasa de fotogramas de 0–20.000 fps y una resolución máxima de 1280 x 860. El sistema cuenta con enfoque automático para la observación en tiempo real del movimiento de gotas y soporta la grabación de imágenes y vídeos, que pueden exportarse en múltiples formatos, incluyendo BMP, AVI, MP4 y TIF.
3. Sistema de detección
   NOTA: Permite la detección de señales fluorescentes con 2 láseres: 488 nm y 633 nm, y 2 canales de detección.
4. Sistema de control del host
   NOTA: Controlado por el software automatizado de plataforma microfluídica de gotas, el sistema integra múltiples módulos, incluyendo actuación de fluidos, imagen microscópica, excitación y detección, generación de gotas, pico-inyección y clasificación. También soporta la adquisición, grabación, almacenamiento, visualización y exportación de datos experimentales. Se muestran unidades operativas parciales de la plataforma microfluídica automatizada de gotas (Figura 1B).
5. Consumibles
   NOTA: Los consumibles utilizados en este protocolo incluyen: tubo de inyección para fase aceitosa, muestra y reactivo (Figura 2A); tubo de recogida para incubación de gotas (Figura 2B); chip de generación de gotas (Figura 2C); chip de pico-inyección de gotas (Figura 2D); y chip de clasificación de gotas (Figura 2E).

4. Generación de gotas

PRECAUCIÓN: Limpia la plataforma microfluídica automática de gotas. Después de cada experimento, limpia el escenario, el portavirutas y cualquier zona de derrame con etanol al 75% usando toallitas sin pelusa. Elimina el aceite fluorado residual, la suspensión de celdas o la solución del sensor.

1. Encapsulación de célula única. Para obtener λ = 0,1 en 14 gotas de pL, se diluye la suspensión bacteriana a un diámetro exterior_{de 600} ≈ 0,04 (el diámetro_{exterior 600}=0,5 corresponde a 1 ×^{10 8} UFC/mL). Según la distribución de Poisson:
   (2)
   Cuando λ = 0,1, el 90,5% de las gotas están vacías, el 9,1% contiene una sola celda y el 0,4% contiene varias celdas.
   NOTA: En este caso, la eficiencia de encapsulación de célula única medida fue del 11,2% (Figura suplementaria 5). El número de celdas por gota puede determinarse mediante la tinción DAPI. Cuando λ = 0,1 y la tasa de encapsulación multicelular supera el 1%, la OD₆₀₀ debe reducirse para disminuir la proporción de gotas que contienen múltiples celdas.
2. Pipetear 300 μL de aceite fluorado en el frasco de entrada de la fase aceitosa. Pipetear 500 μL de la suspensión bacteriana en el frasco de entrada de la fase acuosa.
3. Quita la cinta que cubre la superficie del chip de generación de gotas. Conecta el vial de petróleo, el frasco de muestra y el vial de recogida a los pozos correspondientes del chip en secuencia.
4. Coloca el chip en el escenario y aseguralo. Conecta los tubos de aire a los viales de entrada uno por uno según las etiquetas del camino de gas.
5. Abre el software automatizado de la plataforma microfluídica de gotas. Ajusta el mando de movimiento de la etapa según la dirección de las flechas en el chip para mover el campo de visión al sitio de generación de gotas.
6. Haz clic en "Iniciar" en la interfaz de "Generación de Gotas" del software de plataforma microfluídica automatizada de gotas (Figura 3A). En la interfaz de imagen, arrastra los deslizadores de "eje Z" y de brillo de la fuente de luz para ajustar la nitidez y el brillo de la imagen.
7. Haz clic en los botones "+" y "-" de "Velocidad de gota" y "Tamaño de gota" para ajustar la velocidad de generación y el tamaño de las gotas.
   NOTA: En este caso, la presión en fase aceitosa y la presión en fase de muestra para la generación de gotas se establecen automáticamente a 300 mbar y 400 mbar, respectivamente, para lograr una tasa de generación de 1500 Hz. Bajo estos ajustes, las gotas tienen un volumen de 14 pL, manteniendo el diámetro de la gota por debajo del 5%, asegurando un tamaño constante de las gotas y operaciones fiables aguas abajo.
8. Espera 1 minuto hasta que el equipo se estabilice y el estado de generación de gotas se mantenga constante. Cambia rápidamente el vial de recogida para empezar la recogida de gotas.
   NOTA: Añade previamente una pequeña cantidad de aceite fluorado al nuevo tubo de recogida para cubrir el puerto inferior del tubo de Teflón, asegurando que las gotas no entren en contacto directo con la pared del tubo y provoquen fusión.
9. Detener la recogida de gotas tras 30 minutos de uso. Haz clic en "Parar" en la ventana emergente para confirmar que se ha detenido la generación de gotas.
10. Retira suavemente el tubo de recogida del chip. Coloca el tubo y el vial de recogida en vertical y espera a que las gotas del tubo entren en el frasco de recogida.
11. Retira el visco, el frasco de entrada en fase aceitosa y el vial de entrada en fase acuosa de la etapa. Limpia la superficie del escenario con alcohol al 75%. A continuación, se completa la etapa de generación de gotas.

5. Cultivo de gotas

1. Añade 1 mL de aceite mineral al tubo de recogida.
   NOTA: La capa de aceite mineral cubre la suspensión de gotas para minimizar la evaporación y reducir la exposición al oxígeno, permitiendo al mismo tiempo un intercambio gaseoso suficiente para el anaerobio facultativo B. coagulans.
2. Coloca el tubo de recogida en posición vertical en un tubo centrífugo de 15 mL que contiene agua estéril. Mantén el tubo de recogida ligeramente tapado y incuba a 45 °C durante 10 horas.
   NOTA: Tras la incubación, asegúrese de que el diámetro CV de las gotas sea del <10% y que no se observe coalescencia de gotas. Desecha los lotes si no se cumplen estos criterios.

6. Pico-inyección de gotas

PRECAUCIÓN: Se aplica un alto voltaje a los electrodos del chip mediante la conexión del instrumento durante la pico-inyección. El campo eléctrico puede provocar una descarga eléctrica severa. No toques los electrodos ni la superficie del chip con herramientas metálicas ni con las manos desnudas mientras el alto voltaje esté activo. Siempre desactiva la salida de alta tensión antes de manipular el chip. Lleva guantes aislantes y utiliza herramientas no conductoras.

1. Prepara el frasco de entrada en fase aceitosa. En la campana de flujo laminar, pipetear 300 μL de aceite fluorado en el frasco de entrada de la fase aceitosa.
2. Prepara el frasco de entrada de muestra. Retira la tapa del frasco de entrada del tubo de recogida que contiene las gotas. Cámbialo por un tapón nuevo.
3. Recorta la punta del nuevo frasco de entrada. Corta una pequeña porción del extremo frontal del nuevo frasco de entrada para que la punta llegue por debajo del nivel líquido de las gotas en el vial de muestra.
4. Ajusta la tapa. Asegura bien la tapa para evitar fugas.
5. Prepara el frasco de entrada del reactivo. Pipete 500 μL del sensor de ácido láctico en el frasco de entrada del reactivo.
6. Añade PBS al frasco de entrada del reactivo. Simultáneamente, añadir 500 μL de buffer PBS estéril al mismo frasco de entrada de reactivos.
   NOTA: En este experimento se añade un tampón PBS para equilibrar el pH de las gotas. La concentración final de trabajo del sensor de lactato fue de 0,1 mg/mL, y el volumen de carga del sensor de lactato fue de 500 μL.
7. Usa una cuchilla para cortar la cinta que cubre los pozos de electrodos y exponer los electrodos. Configura el multímetro en modo continuidad y prueba la conexión del circuito y el estado de cortocircuito del chip.
   NOTA: Si el multímetro muestra una conexión normal de circuito de los electrodos del chip, proceda al siguiente paso. Si el circuito está abierto, cambia el chip de inyección y vuelve a probarlo.
8. Después de confirmar la conexión normal del circuito con el multímetro, despega la cinta de la superficie del chip. Conecta el frasco de aceite, el frasco de muestra, el frasco del reactivo y el vial de recogida a los pozos correspondientes del chip en secuencia.
9. Coloca el chip en el escenario y aseguralo. Conecta los tubos de aire a los viales de entrada uno por uno según las etiquetas del camino de gas.
10. Abre el software automatizado de la plataforma microfluídica de gotas. Ajusta el mando de movimiento de la etapa según la dirección de las flechas en el chip para mover el campo de visión hacia el área del electrodo del chip de gotas.
11. Haz clic en "Iniciar" en la interfaz "Droplet Pico-injection" del software automatizado de la plataforma microfluídica de gotas (Figura 3B). En la interfaz de imagen, arrastra los deslizadores de "eje Z" y de brillo de la fuente de luz para ajustar la nitidez y el brillo de la imagen.
    NOTA: En este punto, el instrumento ajusta automáticamente la presión de la bomba en fase aceitosa a 400 mbar, la presión de la bomba en fase de muestra a 420 mbar y la presión de la fase de inyección de reactivo a 450 mbar.
12. En la fase inicial de operación, un segmento de aire en el catéter se libera hacia el chip, lo cual es un fenómeno normal que dura varios minutos.
13. Espera a que las gotas entren en el campo de visión. Haz clic en "Iniciar inyección de Pico". En ese momento, se activará el campo eléctrico del equipo. Ajusta la velocidad de generación de gotas, el espaciado entre gotas y el volumen de inyección haciendo clic en los botones "+" y "-" de "Velocidad de gotas", "Espaciado de gotas" y "Volumen de inyección".
    NOTA: El campo eléctrico está configurado en la marcha máxima por defecto. Si las gotas se rompen en la región del campo eléctrico durante el proceso de fusión, cambia a marcha media o baja. En este caso, la tasa de inyección de gotas era de 200 Hz.
14. Observa en el software de visualización de imágenes de alta velocidad. Si las gotas pueden inyectarse de forma estable en el sensor de ácido láctico en una proporción 1:1, espera 5 minutos a que el equipo se estabilice. Cambia rápidamente el vial de recogida para empezar la recogida de gotas.
15. Después de una inyección estable durante 2 horas, haz clic en "Stop" para terminar la pico-inyección de gotas.
16. Retira suavemente el tubo de recogida del chip. Coloca el tubo y el vial de recogida en vertical y espera a que las gotas del tubo entren en el frasco de recogida.

7. Clasificación por gotas

PRECAUCIÓN: El demulsificante es un irritante y puede causar irritación en la piel y los ojos. También es perjudicial si se inhala o se ingiere. Lleva siempre el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio, gafas de seguridad). Manipula el demulsificante en un lugar bien ventilado o en una campana extractora. Recoge el desecho de desechos en un recipiente separado y claramente etiquetado. No echarles agua por el fregadero.

1. En la campana de flujo laminar, se pipetan 300 μL de aceite fluorado y se añaden al frasco de entrada de la fase oleosa. Sustituye la tapa del frasco de entrada del tubo de recogida que contiene las gotas microinyectadas por una nueva tapa.
   NOTA: Antes de realizar experimentos de clasificación de gotas, toma 5 μL de gotas y obsérvalas bajo un microscopio de fluorescencia. Mide el diámetro de al menos 200 gotas; Procede solo si el CV < 10%.
2. Usa una cuchilla para cortar la cinta que cubre los pozos de electrodos y exponer los electrodos. Configura el multímetro en modo continuidad y prueba la conexión del circuito y el estado de cortocircuito del chip.
3. Después de confirmar la conexión normal del circuito con el multímetro, despega la cinta de la superficie del chip. Conecta el frasco de petróleo, el frasco de muestra y el frasco de recogida de clasificación a los pozos correspondientes del chip en secuencia.
4. Coloca el chip en el escenario y aseguralo. Conecta los tubos de aire a los viales de entrada uno por uno según las etiquetas del camino de gas.
5. Abre el software de imagen de alta velocidad. Ajusta el mando de movimiento de la etapa según la dirección de las flechas en el chip para mover el campo de visión hacia el área del electrodo del chip de gotas.
6. Haz clic en "Iniciar" en la interfaz de "Clasificación de Gotas" del software automatizado de microfluídico de gotas. En la interfaz de imagen, arrastra los deslizadores de "eje Z" y de brillo de la fuente de luz para ajustar la nitidez y el brillo de la imagen.
   NOTA: Tras hacer clic en "Iniciar", el instrumento ajusta automáticamente la presión de la bomba de aceite a 300 mbar y la presión de la bomba de muestra a 190 mbar, resultando en un flujo de gotas de 100 Hz.
7. En la fase inicial de funcionamiento, un segmento de aire en el catéter se descarga en el chip, que dura varios minutos y es un fenómeno normal.
8. Haz clic para seleccionar el "Láser" y elige el canal de detección de 488 nm.
   NOTA: El personal experimental puede seleccionar un láser de 488 nm, un láser de 633 nm o una combinación de ambos, dependiendo del diseño experimental de detección. Potencia láser: 20 mW.
9. Haz clic en "Grabación de datos". El instrumento comenzará a adquirir señales de fluorescencia de gotas (Figura 3C).
   NOTA: Recoger señales de fluorescencia de entre 50.000 y 100.000 gotas; El instrumento ordenará automáticamente los valores de la señal y generará un histograma de señal de fluorescencia.
10. En base al histograma generado de la señal de fluorescencia, se establece el umbral de clasificación al 0,1% superior de las señales de fluorescencia totales y se recogen gotas con valores de señal de fluorescencia superiores a este umbral.
    NOTA: En este caso, la compuerta de clasificación estaba configurada para recoger gotas con intensidad de fluorescencia > 2750 (u.a.), que correspondía al 0,1% superior de las gotas.
11. Haz clic en "Grabación de datos" otra vez. El instrumento volverá a grabar las señales de fluorescencia de las gotas restantes y clasificará las gotas objetivo según el umbral establecido en la Sección 7.10.
    NOTA: Las señales de gotas restantes también se ordenarán y representarán automáticamente como un histograma de fluorescencia.
12. Después de seleccionar la región de gotas objetivo, enciende el "Interruptor de Clasificación" y establece el valor de "Fuerza de Desviación". El equipo empezará a separar las gotas.
    NOTA: El instrumento proporciona tres niveles seleccionables de intensidad de campo eléctrico (Alto, Medio, Bajo). Para gotas mayores a 30 μm, seleccione Alta; para gotas menores de 25 μm, seleccione Medio o Bajo. Esto garantiza una deflexión estable y una eficiencia óptima en la clasificación.
13. Después de que el equipo se estabilice durante 5 minutos, vuelve a colocar el frasco de recogida para recoger las gotas positivas.
    NOTA: Durante la clasificación, el instrumento mide continuamente la intensidad de fluorescencia de cada gota en tiempo real y la compara con el umbral preestablecido. Solo las gotas con intensidad de fluorescencia superior al umbral se desvían y se recogen en el tubo de recogida positiva. Una gota se considera positiva si el instrumento muestra una señal de fluorescencia que supera el umbral de clasificación y, simultáneamente, se observa deflexión de gotas en la interfaz de imagen, confirmando que la gota ha sido dirigida con éxito al canal de recogida positiva.
14. Deja de clasificar las gotas tras 4 horas de funcionamiento estable. Haz clic en "Parar" en la interfaz de "Clasificación de Gotas".
15. Retira suavemente el tubo de recogida del chip. Coloca el tubo y el frasco de recogida en vertical para asegurarte de que las gotas del tubo entren en el vial de recogida.
16. Tras completar la recogida de gotas, haz clic en el diagrama de dispersión para guardar el diagrama de dispersión del experimento, los valores de la señal de fluorescencia de las gotas positivas ordenadas y los valores de la señal de fluorescencia de todas las gotas.
17. Retira el chip, el frasco de entrada en fase aceitosa, el frasco de muestra y el vial del reactivo de la etapa. Cierra el software.
18. Desemulsificación de gotas. Añade 500 μL de 1H, 1H, 2H, 2H, 2H-perfluorooctanol al tubo de recogida de gotas. Espera 5 minutos y luego añade 500 μL de medio de cribado fresco para la recuperación.
    NOTA: No agites vigorosamente el tubo de recogida después de añadir el demulsificante; Mezcla suavemente. Tras la desemulsificación por gotas, se formará una interfaz clara entre las fases acuosa y aceitosa.
19. Toma 20 μL de la suspensión bacteriana demulsificada, dilúyela 10 veces y extiéndela sobre dos placas de agar. Incubar a 50 °C durante 2 días.
    NOTA: El factor de dilución puede ajustarse según el número de gotas recogidas. En este caso, se obtuvieron aproximadamente 400 colonias individuales de las dos placas.

8. Exportación de datos

1. Haz clic en el gráfico de señal de fluorescencia en el área en blanco de la interfaz de ordenación del software. Seleccione para guardar el gráfico de dispersión de la señal de fluorescencia de gotas, el histograma de la señal de fluorescencia y la hoja de cálculo Excel de señales de fluorescencia, que contienen los valores registrados de intensidad de fluorescencia del número total de gotas, así como los valores de intensidad de fluorescencia de las gotas positivas cribadas.

9. Cribado primario de microplacas

1. Elige colonias individuales al azar.
2. Inocular la placa de pozo profundo de 24 pozos para la cultura de expansión. Selecciona cada colonia seleccionada e inocúlala en un pozo de una placa de 24 pozos profundos que contiene 2 mL de medio de fermentación. Usa un anillo de inoculación.
3. Sella la placa de 24 pozos profundos con una membrana no transpirable.
   NOTA: No uses una membrana transpirable. Provoca la evaporación del medio de cultivo.
4. Incuba la cultura de expansión. Coloque la placa de pozo profundo sellada de 24 pozos en una incubadora agitada a 50 °C, 200 rpm durante 24 horas.
5. Subcultura para validación de fermentación. Tras 24 horas, transfiere 200 μL de cultivo de cada pozo a una placa fresca de 24 pozos profundos que contenga 1,8 mL de medio de fermentación (10% v/v inoculum). Añadir CaCO₃ estéril a una concentración final del 4% (p/v) a cada pozo antes de la inoculación para amortiguar el pH.
6. Incluye controles. En cada placa fresca de 24 pozos profundos, llenar tres pozos seleccionados al azar con la cepa parental ATCC 7050 como controles negativos. Procesa las cepas de forma idéntica a las cepas candidatas.
7. Sella la placa de 24 pozos profundos con una membrana no transpirable.
8. Incuba la placa de pozo profundo de 24 pozos. Coloque la placa sellada en una incubadora agitadora a 50 °C, 200 rpm durante 24 horas.
9. Prepara muestras para la detección de lactato. Centrifuga la placa a 5.842 × g durante 10 minutos. Transfiere 10 μL del sobrenadante a una microplaca negra de 96 pozos y diluye con 990 μL de agua ultrapura. Mezcla bien.
10. Añade el sensor de lactato. Añadir 100 μL de la muestra diluida a cada pozo de una placa negra fresca de 96 pozos. Luego añade 100 μL del sensor de ácido láctico. Mezcla suavemente.
11. Mide la fluorescencia. Incuba la placa a temperatura ambiente durante 5 minutos (protegida de la luz). Mide la fluorescencia usando un lector de microplacas con excitación a 485 nm y emisión a 515 nm.
12. Establece el umbral de selección de impacto. Calcular la fluorescencia media de los tres pozos de control parental (padre) y la desviación estándar (SD_parent). Define el umbral como F_parent + 3 × SD_parent.
13. Identifica los impactos primarios. Una cepa candidata se considera un impacto primario si su señal de fluorescencia supera el umbral. Registra el número de resultados primarios para validación posterior.

10. Validación secundaria de deformaciones de alto rendimiento

PRECAUCIÓN: La fase móvil contiene ácido sulfúrico diluido (5 mM), que es corrosivo. Evita el contacto con la piel e inhalación. Lleva el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio, gafas de seguridad). Prepara y maneja la fase móvil en una zona bien ventilada o con una campana extractora. Recoge todos los residuos que contengan ácido en un contenedor dedicado para su correcta eliminación. No echarles agua por el fregadero.

1. Prepara el cultivo de semillas. Estría las líneas de impacto primario sobre las placas de agar del medio semilla. Incuba a 50 °C durante 24 horas. Elige una sola colonia de cada placa y inócula en 30 mL de medio líquido para semilla en un matraz de 250 mL. Incubar a 50 °C, 200 rpm durante 12 horas.
2. Prepara la fermentación. Prepara el medio de fermentación y añade polvo estéril de CaCO3 a una concentración final del 4% (p/v) como neutralizador de pH. Transfiere 5 mL del cultivo de semillas a 45 mL de este medio en un matraz Erlenmeyer de 250 mL (10% inóculo v/v; volumen final de trabajo 50 mL).
   NOTA: Utilice tres matrazas independientes para cada cepa candidata y para la cepa parental ATCC 7050 como control.
3. Incuba los frascos. Coloca los frascos en una incubadora agitada a 50 °C, 200 rpm. Fermenta durante 24 horas.
4. Recoge muestras. Después de 24 horas, toma 1 mL de cultivo de cada matraz. Centrifugar a 13.800 × g durante 2 minutos. Diluye el sobrenadante 100 veces con agua ultrapura y filtra a través de un filtro de jeringuilla de 0,22 μm.
5. Establecer condiciones HPLC. Usa una columna Aminex HPX-87H. Preparar la fase móvil: 5 mM H₂SO₄ en agua ultrapura, filtrar a través de una membrana de 0,22 μm y desgasificar por sonicación. Ajustar la temperatura de columna a 40 °C, caudal a 0,6 mL/min, volumen de inyección a 20 μL y tiempo de funcionamiento a 20 min por muestra (el ácido láctico eluye a ~12,600 min). Utiliza un detector de índice de refracción (RID).
6. Prepara la curva estándar. Disolver el lactato de calcio L en agua ultrapura para preparar soluciones estándar de 0, 0,4, 0,8, 1,2 y 1,6 g/L (expresadas como lactato de calcio L). Inyecta cada estándar en triplicado.
   NOTA: Grafica el área máxima en función de la concentración y obtén la ecuación de regresión lineal (R² > 0,999). Ejecuta estándares al principio y al final de cada lote de muestra para corregir la deriva.
7. Inyecta las muestras. Inyectar los sobrenacionantes de fermentación filtrados (20 μL) en el sistema HPLC. Registra el área del pico para el pico de L-lactato de calcio.
   NOTA: Inyectar una muestra de control de calidad (1 g/L de L-lactato de calcio) cada 10 muestras para monitorizar la estabilidad del sistema. El desplazamiento aceptable del tiempo de retención es de <0,2 min y la variación del área de pico <5% en comparación con el estándar de calibración inicial.
8. Calcula el rendimiento del ácido L-láctico. Interpola el área máxima de cada muestra en la curva estándar para obtener la concentración de lactato de calcio L (g/L).
   NOTA: Convierte a concentración de ácido L-láctico usando la relación de peso molecular:
   (3)
   Calcula el porcentaje de mejora:
   (4)
9. Identifica las últimas cepas de alto rendimiento. Selecciona las cepas que presenten consistentemente un rendimiento de ácido L-láctico mayor que la cepa parental como mutantes validadas. Elige al mejor intérprete para una caracterización más profunda.

11. Evaluación de la estabilidad genética de cepas de alto rendimiento

1. Estira la cepa mutante seleccionada sobre placas de agar de medio semilla. Incuba a 50 °C durante 24 horas. Esto es la primera generación.
2. Elige una sola colonia de la placa de generación 1 e inocúlala en 5 mL de medio líquido para semilla en un tubo de 50 mL. Incubar a 50 °C, 200 rpm durante 12 horas para obtener el cultivo de semillas F1.
3. Transfiere el 10% (v/v) del cultivo de semillas de primera generación a 50 mL de medio de fermentación (que contiene 4% de CaCO₃ estéril en peso por v) en un matraz de batido de 250 mL. Incubar a 50 °C, 200 rpm durante 24 horas.
4. Recoge 1 mL de cultivo después de la fermentación. Centrifugar a 13.800 × g durante 2 minutos, diluir el sobrenadante 100 veces con agua ultrapura y medir la concentración de ácido L-láctico mediante HPLC. Utiliza tres matrazas independientes para cada generación.
5. Para obtener la siguiente generación, traza un lazo del cultivo de primera generación sobre una placa de agar de semilla fresca. Incuba a 50 °C durante 24 horas. Repite los pasos 11.2 y 11.3 para la segunda generación.
6. Repite el proceso de subcultivo para obtener la generación 3 y la generación 4. Para cada generación, preparar tres frascos agitadores y medir la producción de ácido láctico mediante HPLC.
7. Compare los rendimientos de las cuatro generaciones (1–4) utilizando una ANOVA unidireccional o la prueba t de Student. La cepa se considera genéticamente estable si no se observa una diferencia significativa (p > 0,05) en la producción de ácido láctico entre generaciones.

Resultados

Basándose en la plataforma microfluídica automatizada de gotas, se estableció un modelo de cribado de alto rendimiento de capacidad. Se construyó una biblioteca mutante de B. coagulans mediante mutagénesis por ARTP con un tiempo óptimo de irradiación de 20 s, lo que proporcionó una tasa de letalidad de aproximadamente el 90% (Figura 4A). Las células mutantes se encapsularon entonces en gotas de 14 pL, aproximadamente 30 μm de diámetro, a una velocid...

Discusión

Este protocolo presenta un flujo de trabajo estandarizado para el cribado microbiano industrial basado en una plataforma microfluídica automatizada de gotas. El flujo de trabajo integrado abarca la construcción de bibliotecas mutantes, generación de gotas y encapsulación de célula única, cultivo de microreactores, inyección de biosensores, clasificación de gotas activadas por fluorescencia y validación final de cepas objetivo. Utilizando el cribado de alto rendimiento de un B. coagul...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Para la preparación de placas sólidas
Etanol anhidro	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Limpiar y desinfectar bancos y aparatos de laboratorio
Plasma atmosférico y de temperatura ambiente (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	Se empleó ARTP  para construir la biblioteca de mutantes para la mutagénesis de cepas.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	Se utilizó B. coagulans ATCC 7050 como cepa de partida para la mutagénesis y como objetivo del cribado por gotas de alto rendimiento.
Microplaca negra (96 pocillos)	Corning	3925	Se utilizó la microplaca negra de 96 pocillos para ensayos del sensor de lactato y la determinación de la concentración de ácido láctico.
Carbonato de calcio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Para aislar hiperproductores de L-ácido láctico.
Cloruro de calcio	Sinopharm	10005819	El cloruro de calcio se utiliza para la preparación del medio de cultivo microbiano, proporcionando nutrientes esenciales para el crecimiento microbiano.
L-lactato de calcio	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Utilizado como muestras para la preparación de la curva estándar en el proceso de detección.
Tubo de centrífuga (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Utilizado para la dilución de líquidos bacterianos
Tubo de colección	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Para la recolección de gotas y cultivo posterior
Computadora	Lenovo	E450	Instalación de software y control de DREM Cell.
DAPI	Solarbio	c0065	Para la tinción celular.
Placa de pocillos profundos (24 pocillos)	BKMAMLAB	110424008	Para la verificación inicial del rendimiento de los mutantes de B. coagulans utilizando placas de pocillos profundos
Desemulsionador (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	El desemulsionador de gotas se utiliza para romper las microgotas de agua en aceite y liberar las células, cepas o el sobrenadante interno para la detección y el análisis posteriores.
D-Glucosa	Solarbio	G8150-1000	La D-Glucosa se utiliza para la preparación del medio de cultivo microbiano, proporcionando nutrientes esenciales para el crecimiento microbiano.
Citrato de diamonio e hidrógeno	Solarbio	D9950	El citrato de diamonio e hidrógeno se utiliza para la preparación del medio de cultivo microbiano, proporcionando nutrientes esenciales para el crecimiento microbiano.
Fosfato monopotásico anhidro	Sigma-Aldrich	P8281	El fosfato monopotásico anhidro se utiliza para la preparación del medio de cultivo microbiano, proporcionando nutrientes esenciales para el crecimiento microbiano.
Versión del software DREM	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Para controlar el instrumento DREM cell.El software DREM es un programa comercial propietario exclusivo para el instrumento DREM Cell de Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. No tiene acceso oficial público ni URL de descarga y solo se distribuye con el instrumento bajo autorización.
Ordenador de células microfluídico de atrapagotas (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Se utilizó para el encapsulamiento y la clasificación de alta productividad de células individuales para cribar rápidamente cepas de alto rendimiento de la biblioteca de mutantes.
Chip de generación de gotas	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	El chip de generación de gotas se utiliza para producir gotas monodispersas a escala de picolítero (pL) para el encapsulamiento de células individuales.
Chip de inyección de gotas	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	El chip de microinyección de gotas se utiliza para lograr una inyección precisa y de trazas de reactivos en gotas preformadas para reacciones bioquímicas posteriores.
Chip de clasificación de gotas	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	El chip de clasificación de gotas se utiliza para clasificar gotas objetivo que contienen células de alto rendimiento en función de señales de fluorescencia.
Matraz de agitación Erlenmeyer (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Utilizado para la verificación de cultivo a escala de las cepas mutantes de B. coagulans después del cribado primario con placas de pocillos profundos, a fin de confirmar la estabilidad y reproducibilidad de las cepas de alto rendimiento.
Membranas de filtro (0,22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Utilizado para la filtración del caldo de fermentación.
Microscopio invertido de fluorescencia	Olympus	IX73	Se utilizó el microscopio invertido de fluorescencia Olympus IX73 para observar la morfología bacteriana dentro de las gotas
Aceite fluorado	Bio-Rad	1864006	El aceite fluorado sirve como la fase continua en la microfluidización de gotas para generar microgotas de agua en aceite estables, monodispersas y no interferantes, lo que permite el cultivo y cribado de células individuales.
Columna de cromatografía líquida de alta eficacia	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Se utiliza para separar el ácido láctico de otros componentes en el caldo de fermentación según sus diferentes propiedades de retención, con el fin de realizar la detección cuantitativa precisa del ácido láctico.
Cromatografía líquida de alta eficacia	Shimadzu	228-34001-02	La CLPE se utiliza para la detección cuantitativa y el análisis de L-ácido láctico en muestras de fermentación.
Tubo de inyección	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-1N	Para inyectar la fase oleosa, la suspensión bacteriana de la muestra y la solución de reactivo
Sulfato de hierro(III) heptahidratado	Sulfato de hierro(III) heptahidratado	Sulfato de hierro(III) heptahidratado	Sulfato de hierro(III) heptahidratado
Caperuza de flujo laminar	Shanghai SHP Instrument Equipment Co., Ltd	SP20230501	Utilizado para operaciones asépticas en el cultivo y la fermentación de B. coagulans.
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sinopharm	10013018	El extracto de levadura se utiliza para la preparación del medio de cultivo microbiano, proporcionando nutrientes esenciales para el crecimiento microbiano.
Sulfato de manganeso monohidrato	MACKLIN	M813856	El sulfato de manganeso monohidrato se utiliza para