Explorando objetivos para la insuficiencia cardíaca mediante aleatorización mendeliana, colocalización, aleatorización mendeliana basada en datos resumidos y predicción de fármacos

Resumen

Este estudio identificó ocho posibles objetivos farmacologicos para insuficiencia cardíaca mediante análisis genéticos y exploró compuestos terapéuticos candidatos asociados a estos objetivos.

Resumen

La insuficiencia cardíaca (IC) es una enfermedad cardiovascular prevalente que afecta significativamente la calidad de vida en sus etapas avanzadas. A pesar de la variedad de estrategias de tratamiento actuales, la carga de la enfermedad relacionada con la IC sigue siendo significativa. Por lo tanto, es urgente explorar nuevos objetivos terapéuticos. Este estudio utilizó la aleatorización mendeliana (RM) para evaluar las relaciones causales entre los genes farmacológicos y la IC. Se realizó análisis de colocalización y randomización mendeliana basada en datos resumidos (SMR) para validar aún más la relación entre ellos. Finalmente, se identificaron 8 posibles objetivos terapéuticos para la IC, incluyendo 4 factores de riesgo (CYP11A1, GALT, KCNH2 y METRN) y 4 factores protectores (APOM, CHD4, IL11RA y LPAR5). El análisis de la red de enriquecimiento GO, enriquecimiento KEGG e interacción proteína-proteína (PPI) indicó que estos genes estaban principalmente implicados en la regulación metabólica y los procesos electrofisiológicos cardíacos. Además, se identificaron posibles fármacos dirigidos a estos objetivos mediante predicción de fármacos y acoplamiento molecular, incluyendo mitotano, adehl, benzofuranos, 1,3-Di-o-tolilguanidina, 96-69-5 y lactona bromoenol. Además, los resultados de la PCR demostraron que el mitotano podría estar asociado con CYP11A1 y KCNH2. Los fármacos diseñados en función de estos posibles objetivos terapéuticos pueden ofrecer tasas de éxito más altas y mejorar los resultados clínicos.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (IC) es un síndrome cardiovascular prevalente definido por un empaste ventricular alterado o una contractilidad miocárdica, que resulta en un gasto cardíaco insuficiente para satisfacer las demandas^{metabólicas 1,2,3}. Clínicamente, la IC se caracteriza por congestión pulmonar y sistémica, hipoperfusión tisular y síntomas como disnea, fatiga y edema^{periférico 1,4,5}. A pesar de los avances terapéuticos, la IC sigue siendo una de las principales causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, afectando a más de 64 millones de personas según el estudio Global Burden of Disease (GBD^{) 6,7,8}. La considerable carga de la enfermedad subraya la urgente necesidad de nuevas estrategias terapéuticas.

Las intervenciones farmacológicas y basadas en dispositivos actuales para la IC están limitadas por una eficacia subóptima y efectos adversos, lo que contribuye a tasas persistentemente altas de rehospitalización y a una calidad de vida^deteriorada 9,10,11,12. Por tanto, identificar nuevos objetivos moleculares con vínculos causales con la patogénesis de la IC es fundamental para mejorar los resultados clínicos. Integrar la genómica en el descubrimiento de fármacos representa una estrategia altamente eficaz para mejorar la eficiencia, ya que las terapias genéticamente validadas demuestran una tasa de éxito significativamente mayor en ensayos^{clínicos 13, 14 y 15}. Además, las proteínas codificadas por estos genes accionables sirven como blancos terapéuticos principales tanto para moléculas pequeñas como para anticuerpos^{monoclonales 16,17}.

Los avances recientes en genética humana han facilitado la priorización de objetivos farmacológicos mediante el análisis integrativo de estudios de asociación genómica a nivel genómico (GWAS) y datos de loci cuantitativos de rasgos de expresión (eQTL). La aleatorización mendeliana (RM) utiliza variantes genéticas como variables instrumentales para estimar los efectos causales, minimizando la confusión y la causalidad inversa inherentes a los estudios^{observacionales 13,14}. Cuando se combina con la colocalización y la RM basada en resumen (SMR), este enfoque permite una priorización robusta de genes cuya modulación puede influir en el riesgo de enfermedad, ofreciendo una estrategia genéticamente anclada para el descubrimiento de objetivos 18,19,20. En comparación con los estudios de asociación convencionales, integrar la RM, la RMS y la colocalización supera la confusión y la causalidad inversa para establecer inferencias causales robustas. Además, este marco filtra las señales falsamente positivas del desequilibrio de ligamiento asegurando que la expresión génica y el riesgo de insuficiencia cardíaca compartan la misma variante causal subyacente, optimizando la priorización de objetivos. Cabe destacar que, aunque los tejidos cardiovasculares muestran alta especificidad, este estudio utiliza principalmente datos sanguíneos cis-eQTL a gran escala para maximizar el poder estadístico. Aunque este enfoque puede no captar completamente los mecanismos específicos de los tejidos inherentes a la IC, las variantes derivadas de la sangre actúan como biomarcadores accesibles y proporcionan información sólida sobre los factores genéticos sistémicos de la enfermedad.

En este estudio, se utilizaron conjuntos de datos GWAS y eQTL a gran escala para evaluar los efectos causales de genes farmacológicos sobre el riesgo de HF. Las asociaciones significativas se validaron aún más mediante la colocalización y análisis de SMR. Para dilucidar las funciones biológicas de los objetivos priorizados, se realizaron análisis de enriquecimiento de la Ontología Génica (GO) y la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG), junto con análisis de redes de interacción proteína-proteína (PPI). Posteriormente, el potencial terapéutico se evaluó mediante la predicción de fármacos y el acoplamiento molecular. Finalmente, las asociaciones entre genes fármacos seleccionados y fármacos candidatos se validaron mediante experimentos in vitro .

En conclusión, este estudio ofrece importantes perspectivas para el descubrimiento de nuevos objetivos terapéuticos para la IC. Mediante el uso de RM, SMR, análisis de colocalización, análisis de enriquecimiento génico, construcción de redes de PPI, predicción de fármacos, acoplamiento molecular y experimentos in vitro , estos hallazgos pueden contribuir al desarrollo de estrategias terapéuticas más eficaces para la IC.

Protocolo

Todos los conjuntos de datos utilizados en este estudio se obtuvieron de estudios previamente publicados con aprobación ética. Los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Diseño del estudio

El flujo de trabajo de este estudio se ilustra en la Figura 1. Primero, se obtuvieron datos de exposición a partir de los cis-eQTLs de genes farmacológicos. En segundo lugar, se realizó un análisis por RM para investigar la relación causal entre los genes farmacológicos y la IC. Posteriormente se identificaron objetivos terapéuticos candidatos para la IC mediante análisis de colocalización y SMR. A continuación, se realizaron análisis de enriquecimiento génico y construcción de redes PPI. Finalmente, se realizaron predicciones de fármacos y acoplamientos moleculares para explorar la afinidad de los fármacos hacia los genes.

2. Fuente de datos

Se identificaron un total de 6.888 genes farmacológicos de dos fuentes. Un conjunto de datos incluía 4.463 genes de un estudio previamente publicado que integraba múltiples fuentes de^{datos 17}. El otro conjunto de datos contenía 5.012 genes de la Base de Datos de Interacciones Fármaco-Génica (DGIdb)²¹. La información detallada se ilustró en la página web (https://www.dgidb.org/). Tras fusionar y eliminar duplicados, se conservaron 6.888 genes farmacológicos únicos para su análisis.

Los datos Cis-eQTL se obtuvieron del Consorcio eQTLGen (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html), que incluye perfiles de expresión de 31.684 muestras de sangre y cubre 16.987^{genes 22}.

Las estadísticas resumen de HF se obtuvieron de la versión R12 de la base de datos^{FinnGen 23}, que incluía 37.653 casos y 462.695 controles en el formulario. El diagnóstico de la IC se basó en la Clasificación Internacional de Enfermedades (CIE), incluyendo la CIE-10—I11.0, I13.0, I13.2, I50, CIE-9—4029B|428 e ICE-8—42700|42710|428|7824. Todos los participantes eran de ascendencia europea. La información detallada está disponible en la página web de FinnGen y en el artículo original (https://www.finngen.fi/en/access_results).

3. Análisis de aleatorización mendeliana

Se seleccionaron variables instrumentales (IV) basándose en tres supuestos fundamentales de la RM^{: 24}. En primer lugar, las vías intravenosas están directamente asociadas con los factores de exposición. En segundo lugar, las vías intravenosas no están asociadas con factores de confusión. Por último, las vías intravenosas afectan el resultado solo por exposición. Dado que los eQTLs proximales ejercen un control regulatorio más inmediato y robusto sobre los genes objetivo, la RM utilizó exclusivamente SNPs situados en regiones de 100 kb de los genes para maximizar la proximidad biológica. Se emplearon criterios estrictos para la selección del SNP. Todos los SNPs seleccionados se localizaron a menos de 100 kb aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción y a 100 kb aguas abajo del sitio final de transcripción de cada gen farmacológico. Solo se incluyeron los SNPs con significación genómica (p < 5×^10-8)²⁵. Para minimizar el desequilibrio de ligamiento (LD), se realizó agrupación de LD utilizando un umbral^r2 de 0,001 y una distancia de agrupamiento de 10.000 kb²⁶. Se conservaron SNPs con estadísticas F >10, calculadas usando la fórmula: F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)]²⁷. La información sobre los SNP se proporciona en la Tabla Suplementaria 1.

Los métodos analíticos principales fueron ponderado por inversa de varianza (IVW) y la razón de Wald. Un valor p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente^{significativo 28,29}. Se aplicó la tasa de falsos descubrimientos (FDR) para ajustar el valor p y minimizar los resultados falsos^{positivos 30}. Cuando solo había un SNP disponible, se utilizaba el método de la relación de Wald; de lo contrario, se aplicó la FIV. Los análisis incluyeron MR-Egger, mediana ponderada, modo ponderado y modo simple cuando había suficientes SNPs presentes.

Se emplearon la prueba Q de Cochran y el análisis de interceptaciones MR-Egger para evaluar la heterogeneidad y la pleiotropía. Un valor q-p mayor que 0,05 indicó la ausencia de heterogeneidad³¹. Un valor p para la intersección MR-Egger inferior a 0,05 indicó la presencia de pleiotropía^{direccional 18}. Finalmente, se realizó la prueba de dejar uno fuera para comprobar si los resultados podían ser influenciados por un solo SNP. Los análisis de RM se realizaron utilizando el paquete TwoSampleMR (versión 0.6.11) en R (versión 4.4.2).

4. Análisis de colocalización

El análisis de colocalización se realizó utilizando el paquete Coloc R (versión 6.0.1) para identificar si las variantes genéticas compartidas influían tanto en la expresión génica como en el riesgo^{de HF 32}. Las probabilidades previas de que un SNP estuviera asociado a cualquiera de los rasgos y ambos rasgos se establecieron en 1 × ^10-4 y 1 × ^10-5, respectivamente. Se pueden calcular las probabilidades posteriores de las cinco hipótesis: (1) PPH0: Los SNPs no están vinculados a dos rasgos. (2) PPH1/PPH2: Los SNPs están asociados con la expresión génica o HF. (3) PPH3: Los SNPs están vinculados con HF y expresión génica, pero están impulsados por SNPs diferentes. (4) PPH4: Los SNPs están vinculados con HF y expresión génica, y son impulsados por los SNPs comunes. Se consideró evidencia de colocalización un PPH4 > 0,8.

5. Análisis SMR

El análisis SMR se realizó para explorar la relación entre el gen y HF utilizando el software SMR (versión 1.3.1)³³. Se realizó la prueba de heterogeneidad en instrumentos dependientes (HEIDI) para determinar si las asociaciones observadas se debían a la vinculación. Un valor p significativo de SMR (< 0,05) combinado con un valor p HEIDI > 0,05 se interpretó como evidencia que apoyaba una verdadera relación causal más que como una asociación causada por el escenario de vinculación. Los protocolos operativos detallados y los ajustes computacionales pueden consultarse en la página web oficial.

6. Análisis de enriquecimiento

Se empleó el análisis de enriquecimiento GO y KEGG para caracterizar las funciones biológicas y las vías de los genes objetivo terapéuticos potenciales^{cribados 34}. El enriquecimiento de GO incluía procesos biológicos (BP), funciones moleculares (MF) y componentes celulares (CC). El paquete R clusterProfiler (versión 4.14.6) y Pathview (versión 1.46.0) se utilizaron para realizar el análisis^{de enriquecimiento 35,36}.

7. Predicción de fármacos candidatos

Para identificar posibles compuestos terapéuticos, se realizó un análisis de predicción de fármacos utilizando la Base de Datos de Firmas de Fármacos (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)³⁷. El DSigDB incluye 22.527 conjuntos de genes, incluyendo 17.389 compuestos únicos que cubren 19.531 genes. Se analizaron las asociaciones entre genes candidatos y compuestos, seguidas de un análisis de enriquecimiento para identificar fármacos potencialmente relevantes dirigidos a genes asociados a la HF.

8. Construcción de redes de interacción proteica

Se construyeron redes de interacción proteína-proteína (IBP) utilizando GeneMANIA (https://genem ania.org/)³⁸. GeneMANIA podría ayudar a generar hipótesis de función génica, analizar listas genéticas y priorizar genes para pruebas funcionales.

9. Acoplamiento molecular

Se realizó acoplamiento molecular para validar la capacidad de medicamento de los genes y su relación con los candidatos a fármacos. Las simulaciones de acoplamiento ayudan a evaluar la afinidad de unión y los patrones de interacción entre compuestos y proteínas objetivo, informando así la priorización y optimización de los candidatos. Las estructuras proteicas se extrajeron del Banco de Datos de Proteínas (PDB) (http://www.rcsb.org/), y las estructuras de compuestos se obtuvieron de PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)³⁹. El acoplamiento se realizó utilizando CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php), que utiliza detección de cavidades para guiar el acoplamiento^{ciego 40,41}. Los procedimientos operativos detallados y la información sobre los ajustes de cálculo pueden obtenerse en la página web oficial.

10. Cultivo celular

Las células cardiomiocitarias inmortalizadas en humanos (AC16) se cultivaron en un medio de cultivo específico para células AC16 bajo condiciones estériles. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía un 5% de CO2. El medio de cultivo se reemplazaba cada 2–3 días, y las células se trasladaban a una confluencia aproximadamente del 70%–80% para mantener condiciones óptimas de crecimiento. La morfología celular y la confluencia se monitorizaban rutinariamente mediante microscopía óptica antes de cada experimento. Todos los procedimientos de cultivo celular se realizaron en un gabinete de bioseguridad para minimizar el riesgo de contaminación. Para los experimentos de tratamiento, las células AC16 se sembraron en placas de 6 pozos y se dejó adherirse durante la noche antes de la administración del tratamiento.

11. PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-PCR)

Las células AC16 fueron tratadas con ácido palmítico (PA) de 200 μM o mitotano de 20 μM durante 24 horas tras alcanzar aproximadamente una confluencia del 60%–70%. La PA se disolvía en albúmina sérica bovina (BSA), mientras que el mitotano se disolvía en dimetilsulfóxido (DMSO). Todos los reactivos potencialmente peligrosos se manejaron conforme a los procedimientos estándar de seguridad de laboratorio utilizando el equipo de protección personal adecuado, incluidos guantes y batas de laboratorio.

Tras el tratamiento, se extrajo ARN total utilizando un kit de extracción de ARN según las instrucciones del fabricante en condiciones libres de RNasa. Los procedimientos de extracción de ARN se realizaron sobre hielo siempre que fue posible para minimizar la degradación del ARN. La concentración y pureza de ARN se evaluaron antes de los experimentos posteriores, y solo se utilizaron muestras con una relación A260/A280 entre 1,8 y 2,0 para los análisis posteriores.

El ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando un kit de transcripción inversa según el protocolo del fabricante. Posteriormente, se realizó una RT-PCR cuantitativa utilizando SYBR Green Master Mix en un sistema de detección de PCR en tiempo real. Cada reacción se preparó en un volumen final de 10 μL que contiene 5 μL de SYBR Green Master Mix, cebador directo de 0,4 μL, cebador inverso de 0,4 μL, plantilla de ADNc de 1 μL y 3,2 μL de agua sin nucleasa. La amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones de ciclo: desnaturalización inicial a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 5 s y recocido/extensión a 60 °C durante 30 s. Cada experimento se realizó con tres réplicas biológicas, y todas las reacciones se realizaron en triplicado.

Se utilizó GAPDH como gen de referencia interno, y los niveles relativos de expresión de ARNm de CYP11A1 y KCNH2 se calcularon mediante el método 2^−ΔΔCt. Un solo pico en el análisis de curvas de fusión se consideró indicativo de una amplificación específica. Las secuencias de cebadores utilizadas para RT-PCR se enumeran en la Tabla Suplementaria 2.

Resultados

Aleatorización mendeliana
Los resultados de la RM que evaluaron los efectos causales entre la expresión génica farmacológica y la IC se presentaron en la Tabla Suplementaria 3. Se consideró estadísticamente significativo un valor de P ajustado por FDR inferior a 0,05. Se identificaron un total de 11 genes con asociaciones causales significativas con la IC (Figura 2). Entre ellos, seis genes se asociaron con un mayor riesg...

Discusión

Esta investigación evaluó sistemáticamente los efectos causales de los genes farmacológicos sobre el riesgo de IC utilizando la RM, identificando ocho posibles objetivos terapéuticos. Estos incluían cuatro factores protectores (APOM, CHD4, IL11RA y LPAR5) y cuatro factores de riesgo (CYP11A1, GALT, KCNH2 y METRN). Estas asociaciones se vieron además respaldadas por el análisis de colocalización y la SMR. La anotación funcional mediante análisis de redes GO, enriquecimiento KEGG y PPI sug...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16 medio de cultivo específico para células	HyCyte	TCH-G119
Kit de inversión de cDNA	Abclonal	RK20400
Sistema de tiempo real CFX96™	Bio-Rad Laboratories
Mitotano	TargetMol	T1199
Ácido palmítico	TargetMol	T2908
Kit de extracción de RNA	Abclonal	RK30120