Artículo de investigación
Este estudio exploratorio con ratas presenta una microaguja activa con dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) sensible a redox para intervención simultánea con acupuntura y seguimiento ratiométrico de índices SERS relacionados con la capacidad oxidativa local y el potencial redox en ratas con tolerancia a glucosa deteriorada.
La tolerancia deteriorada a la glucosa (IGT) se asocia con una alteración de la homeostasis redox y un aumento del estrés oxidativo, pero el seguimiento dinámico in vivo de los cambios asociados a la redox durante la intervención de acupuntura sigue siendo técnicamente complicado. Este estudio desarrolló un sistema de microagujas activas con dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) sensible a redox para intervenciones simultáneas de acupuntura y seguimiento ratiométrico relativo de índices SERS relacionados con capacidad oxidativa (CO) y potencial redox (RP) en ratas con IGT. Se prepararon sondas SERS sensibles a la oxidación y redox funcionalizando nanocáscaras de oro (GNS) con p-fenilendiamina (p-PDA) para la respuesta al CO y antraquinona para la respuesta al RP, respectivamente. Las sondas se cargaban en dos ranuras grabadas en agujas de acupuntura para construir microagujas activas en SERS. En este estudio exploratorio se utilizaron ratas macho de Sprague–Dawley libres de patógenos específicos. Tres ratas actuaron como controles normales, y 20 ratas fueron alimentadas con una dieta alta en grasas y administradas estreptozotocinas (STZ) para inducir la IGT. Tras el cribado, 18 ratas IGT elegibles se dividieron en grupos de dieta alta en grasas y de dieta normal, con 9 ratas por grupo de dieta. Cada grupo dietético se dividió además en subgrupos de torsión por puntos de acupuntura, torsión no por sitio de acupuntura y subgrupos de inserción directa en puntos de acupuntura, con 3 ratas por subgrupo. Se realizó punción dos veces al día durante 7 días consecutivos, y se registraron la glucosa en ayunas (FPG), la glucosa postprandial de 2 horas (2hPG) y los índices SERS relacionados con OC y RP. Los resultados mostraron que el punción en puntos de acupuntura con torsión se asoció con valores más bajos de FPG y 2hPG y alteró los índices SERS relacionados con OC y RP en este modelo de rata IGT. Dado que no se incluyeron curvas de calibración externas, ensayos bioquímicos independientes de estrés oxidativo, pruebas de lixiviación con sonda ni ensayos de biocompatibilidad, las relaciones SERS deben interpretarse como índices ópticos relativos asociados a redox en lugar de concentraciones bioquímicas absolutas o valores absolutos de potencial redox. Estos hallazgos apoyan la viabilidad de las microagujas activas en SERS como plataforma preclínica exploratoria para combinar la intervención con acupuntura con seguimiento SERS ratiométrico local en ratas IGT.
La tolerancia deteriorada a la glucosa (IGT), que es decir, una disminución en la capacidad del cuerpo para tolerar la glucosa, representa una etapa de transición entre la glucosa normal en sangre y la glucosadiabética 1. La IGT es, por tanto, una señal clave de alerta temprana y una etapa reversible en el desarrollo de la diabetestipo 2. Los datos clínicos muestran que aproximadamente el 30% de la población con IGT progresará a diabetes tipo 2 en un plazo de 5–10años; Sin embargo, con una intervención oportuna, este porcentaje puede reducirse a menos del 10%.
La IGT es un proceso dinámico y complejo, y un entorno persistente con alta glucosa es un desencadenante clave para los trastornos del metabolismooxidativo 5. Cuando el cuerpo está en un estado prolongado de hiperglucemia, la cadena respiratoria mitocondrial funciona de forma anormal y la tasa de generación de especies reactivas de oxígeno aumenta entre un 30 y un 50%, aumentando directamente el poder oxidativo enel organismo 6; Simultáneamente, los altos niveles de azúcar inhiben la actividad de enzimas clave, como la glutatión reductasa, impidiendo que el sistema antioxidante elimine el exceso de especies reactivas de oxígeno de forma oportuna y alterando aún más el equilibrio oxidación-reducción. Además, la IGT va acompañada de cambios patológicos, incluyendo resistencia a la insulina y un leve deterioro de la función β-celular, lo que da lugar a una variedad de respuestas biológicas ybioquímicas 7,8. Junto con la evolución del estado redox, estos cambios agravan aún más la alteración del metabolismo de la glucosa y aumentan el riesgo potencial de complicaciones de la diabetes, incluyendo retinopatía, nefropatía y enfermedadescardiovasculares. Por lo tanto, monitorizar la capacidad oxidativa (CO) y el potencial redox (RP) en individuos o modelos animales con IGT debería mejorar nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes al desarrollo de la IGT y guiar el diseño de estrategias terapéuticas específicas.
La acupuntura tiene una historia de más de 3.000 años y ha demostrado una buena eficacia clínica en el tratamiento de muchas enfermedades11. Además, numerosos estudios experimentales en animales han demostrado que la acupuntura ejerce efectos beneficiosos en la regulación de los estados de estrés oxidativo en modelos animales al potenciar el sistema enzimático antioxidante y reducir la peroxidaciónlipídica 12. Como práctica médica tradicional china, la acupuntura también ha demostrado beneficios significativos en el tratamiento de la diabetes y la IGT. Se ha informado que los puntos de acupuntura Guanyuan (CV4) y Sanyinjiao (SP6) activan la vía SIRT1/PGC-1α en el músculo esquelético, aliviando así la resistencia a la insulina en ratones diabéticosobesos 13. Además, los puntos de acupuntura de Tianshu (ST25) modulan la actividad de las neuronas inhibidoras de la glucosa ubicadas en la región hipotalámica lateral y contribuyen a la regulación del metabolismo de los glicolípidos14. Sin embargo, la mayoría de los estudios sobre los mecanismos de la acupuntura intravascular se han centrado principalmente en los sistemas neuromodulador, inmunomodulador y gastrointestinal, en los que la acupuntura puede afectar el metabolismo de la glucosa mediante la modulación de la función autónoma o regular indirectamente los niveles de glucosa en sangre al mejorar el equilibrio de la flora intestinal15,16. El mecanismo específico del efecto de la acupuntura en el tratamiento con IGT y sus efectos sobre el estrés oxidativo han carecido de investigación profunda y respaldo de datos experimentales.
La dispersión Raman mejorada en superficie (SERS) proporciona gran sensibilidad y especificidad, lo que permite la detección de una amplia variedad de analitos. Las nanosondas SERS basadas en nanofibras ópticas17, membranasquitosanas 18 y estudios previos han demostrado que las agujasde acupuntura 19 pueden utilizarse para la detección de biomarcadores, neurotransmisores y otros aspectos de la bioquímica celular in vivo. Las agujas de acupuntura, en particular, representan herramientas prometedoras para la prueba de tejido profundo, permitiendo un monitoreo in situ mínimamente invasivo seguido de análisis ex vivo. La acupuntura, como método terapéutico bien establecido, tiene una gama extremadamente amplia de aplicaciones clínicas. Estudios recientes han demostrado que las fibras ópticas, los apósitos de heridas y los dispositivos de microaguja habilitados con SERS pueden soportar el seguimiento in situ o mínimamente invasivo de señales asociadas a redox en entornos biológicamenterelevantes 20,21. Paralelamente, las agujas de acupuntura activas con SERS y sistemas relacionados de microagujas han surgido como portadores prometedores para integrar la capacidad de detección con la intervencióntisular 19, resultando en microagujas activas en SERS con respuesta in vivo y capacidades de detección in vitro de SERS.
El presente estudio se basa en la estrategia previamente informada de microagujas activas SERS para detectar señales relacionadas con la capacidad oxidativa y el potencial redox en modelos de estrés inducido por glucosa. Sin embargo, el presente trabajo difiere del estudio anterior tanto en contexto biológico como en propósito experimental. Específicamente, este estudio aplica la plataforma de microagujas activa SERS a un modelo de rata con tolerancia deteriorada a la glucosa e integra el seguimiento local ratiométrico del SERS con intervención de acupuntura. El estudio actual compara además los puntos de acupuntura con sitios adyacentes no acupunturas, evalúa diferentes manipulaciones de punción y monitoriza los índices SERS asociados a redox durante un periodo de intervención de 7 días. En comparación con las fibras ópticas basadas en SERS, apósitos y microagujas activas para SERS diseñadas principalmente para la detección bioquímica de un solo sitio o de función única, la plataforma actual ofrece dos avances. Primero, las sondas sensibles a la OC y RP se integran en dos ranuras grabadas independientes en una sola aguja de acupuntura, permitiendo el monitoreo simultáneo de parámetros redox complementarios. En segundo lugar, la aguja de acupuntura funciona no solo como portadora de la sonda SERS, sino también como dispositivo terapéutico, permitiendo realizar monitorización redox durante la intervención de acupuntura en lugar de después del tratamiento. Como se muestra en la Figura 1, tras insertar las microagujas en los tejidos, se producen pequeñas heridas y las sondas en las dos ranuras reaccionan con los tejidos, permitiéndoles detectar niveles de CO y RP in vivo. El objetivo del estudio fue utilizar estas microagujas activas en SERS para examinar los cambios en el CO y RP en ratas con IGT y determinar los efectos de la acupuntura emparejada con puntos de acupuntura en estos animales, obteniendo así valiosos conocimientos sobre el mecanismo de efecto de la acupuntura en el tratamiento de la IGT y la relación entre los estados redox e hiperglucémicos anormales.
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Animales y modelos de IGT
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Instituto de Investigación de la Universidad del Sureste de Suzhou (número de aprobación). SEU-IACUC-20250318007) y se realizaron conforme a las directrices institucionales para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Las ratas fueron obtenidas y alojadas bajo condiciones libres de patógenos específicos (SPF) a 25 °C con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para procedimientos que requerían anestesia, las ratas eran anestesiadas usando isoflurano administrado en oxígeno a través de una cámara de inducción y mantenidas mediante un cono nasal. Se utilizó isoflurano al 3% para inducción y 1% para mantenimiento, ajustando la concentración según la frecuencia respiratoria y la respuesta del procedimiento.
Se confirmó una profundidad anestésica adecuada antes de puncionar o inyección mediante la pérdida del reflejo de enderezamiento y la ausencia de respuesta al pellizco del dedo del pie. Durante la anestesia, se monitorizaba el patrón respiratorio, la posición corporal y la recuperación, y los animales se colocaban sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura corporal. Los animales se alojaban 2 por jaula con acceso libre a comida y agua, salvo que fuera necesario ayunar para la prueba de glucosa. Tras la llegada, las ratas se aclimataron durante una semana antes de la inducción del modelo. El bienestar animal se monitorizaba diariamente, incluyendo la actividad general, el aseo, la ingesta de alimentos, el peso corporal, la condición en el lugar de inyección y la recuperación tras la anestesia. Al final del estudio, las ratas fueron sacrificadas según el protocolo animal aprobado. La eutanasia se realizó mediante inhalación gradual de CO₂ de llenado, seguida de la confirmación de la muerte mediante el método de la luxación cervical. Los animales que cumplían los criterios humanos de desenlace, incluyendo pérdida de peso severa, inmovilidad persistente, respiración anormal, incapacidad para comer o beber, o malestar severo, fueron eutanasiados inmediatamente en lugar de mantenerse hasta el punto final programado. En este estudio se utilizaron ratas macho de Sprague–Dawley de grado específico libre de patógenos, que pesaban entre 200 ± 20 g. Tras una semana de aclimatación, las ratas se asignaron aleatoriamente en dos grupos: las tres ratas del grupo normal fueron alimentadas con comida normal, mientras que las 20 ratas del grupo modelo fueron alimentadas con comida alta en grasa (50% comida basal + 10% grasa + 25% sacarosa + 15% polvo de yema) durante 3 semanas. Los animales del grupo modelo recibieron inyección intraperitoneal de 20 mg/kg de solución STZ al 2% (solubilizada en 0,1 mol/L, tampón de citrato pH 4,4) durante 12 horas, tras 12 horas de ayuno sin restricción de agua. Los del grupo normal recibieron una inyección intraperitoneal de la dosis correspondiente de solución tampón de citrato tras ser alimentados con comida normal. Una semana después se realizó una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT). Los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
La glucosa en ayunas (FPG) se midió mediante la extracción de sangre en la punta de la cola de ratas de cada grupo tras 12 horas de ayuno sin restricción de agua, y se registró 2 horas de glucosa postprandial (2hPG) tras la inyección intraperitoneal de dextrosa al 20% 2 g/kg. En el grupo normal, el rango de FPG era de 5,1–6,6 mmol/L, y el rango de glucosa de 2hPG era de 7,3–9,4 mmol/L, en comparación con un FPG de ≤7,0 mmol/L y un rango de 2hPG de 10–16 mmol/L en el grupo modelo. De las 20 ratas asignadas a la inducción del modelo IGT, 18 cumplieron los criterios predefinidos de la IGT tras la IPGTT y fueron incluidas en el experimento de intervención posterior. Se excluyeron dos ratas porque sus valores de FPG o 2hPG estaban fuera del rango predefinido de IGT. Las 18 ratas elegibles fueron asignadas aleatoriamente a un grupo con dieta alta en grasas y otro a un grupo de dieta normal, con 9 ratas por grupo. Cada grupo de la dieta se dividió además en tres subgrupos: torsión por punto de acupuntura, torsión no por sitio de acupuntura e inserción directa por punto, con tres ratas por subgrupo. Se trató de un estudio exploratorio de desarrollo de métodos diseñado para evaluar la viabilidad de combinar la intervención con acupuntura con el seguimiento ratiométrico basado en SERS en un modelo preclínico de rata IGT. No se realizó ningún cálculo estadístico formal de potencia. El tamaño del subgrupo de tres ratas se seleccionó en función de la viabilidad, los estudios preliminares SERS-microaguja y el principio de reducción animal. Las ratas fueron asignadas aleatoriamente por el experimentador; no se realizaron ocultaciones formales ni cegamientos de asignación.
Los protocolos de tratamiento con acupuntura se analizaron con referencia a las directrices clínicas basadas en la evidencia para la medicina tradicional china y la viabilidad de los experimentos conanimales 22. Los puntos de acupuntura seleccionados fueron Zhongwan (RN12/CV12), Shuifen (RN9/CV9), Yinjiao (RN7/CV7), Tianshu bilateral (ST25), Shuidao bilateral (ST28) y Zusanli bilateral (ST36). RN12, RN9 y RN7 se localizaron en la línea media anterior y se trataron como puntos de línea media individual, mientras que ST25, ST28 y ST36 se trataron bilateralmente. Los emparejamientos de puntos de acupuntura se basaron en los utilizados para el tratamiento clínico de IGT23. La adaptación se basó en la literatura 24,25, utilizando el método dicotómico. En las ratas, los puntos de acupuntura se localizaron según los puntos anatómicos y la conversión proporcional desde ubicaciones estándar de puntos de acupuntura humanos. Los puntos de enfermería abdominal/CV se identificaron a lo largo de la línea media anterior utilizando el proceso xifoides, el ombligo y la sínfisis púbica como hitos anatómicos. ST25 se marcó bilateralmente a nivel umbilical, y ST28 se marcó bilateralmente en la región abdominal inferior, a la misma distancia lateral de la línea media anterior. ST36 fue identificada en la extremidad posterior anterolateral de la región tibial anterior, lateral al tubérculo tibial. Los sitios de comparación adyacentes no relacionados con acupuntura se marcaron 5 mm laterales a los puntos de acupuntura correspondientes y fuera de la línea del meridiano reconocida, evitando vasos visibles, cicatrices y puntos de punción previos. Antes de punchar, las ratas eran anestesiadas con isoflurano según el protocolo animal aprobado y colocadas en posición supina sobre una almohadilla térmica. La piel abdominal y de las extremidades posteriores sobre cada zona objetivo fue afeitada y desinfectada con etanol al 75%. Se insertaron microagujas activas con SERS aproximadamente perpendiculares a la piel hasta una profundidad de aproximadamente 10 mm. Para los grupos de torsión de puntos de acupuntura, se insertaron microagujas activas en SERS en los puntos seleccionados y se rotaron suavemente en bidireccional durante el periodo de retención de 20 minutos. Para los grupos sin sitios de acupuntura, se realizó el mismo procedimiento en los puntos de comparación adyacentes de 5 mm sin acupuntura. Para los grupos de inserción directa, se insertaron microagujas activas SERS en los puntos de acupuntura y se retuvieron durante 20 minutos sin torcer. Todos los procedimientos de agujación fueron realizados por el mismo operador entrenado para minimizar la variación entre operadores.
La punción se realizaba dos veces al día, a las 10:00 y a las 15:00, durante 7 días consecutivos. Antes de cada procedimiento diurno, se midió la FPG tras 8 horas de ayuno sin restricción de agua. Tras cada procedimiento diario de punción, se registraron las respuestas de OC y RP. Al día 7, tras el tratamiento de acupuntura, se realizó la IPGTT y se registraron valores de 2hPG.
Precauciones
La estreptozotocina es peligrosa y debe tratarse como un químico tóxico. Prepara la solución de estreptozotocina en una campana extractora química o en un armario certificado de bioseguridad, mientras llevas bata de laboratorio, guantes de nitrilo, gafas protectoras y mascarilla. Las jeringuillas, agujas, toallitas, camas, jaulas y residuos relacionados con animales contaminados con estreptozotocinas deben manipularse conforme a los procedimientos institucionales peligrosos de residuos biológicos y químicos. Las agujas y jeringuillas usadas deben desecharse inmediatamente en recipientes para punzantes resistentes a la perforación sin volver a tapar.
Fabricación de microagujas SERS activas para la detección de CO y RP
Se prepararon agujas de acupuntura como se había informadopreviamente en 26. Las microagujas activas para SERS se fabricaron utilizando el mismo tipo de agujas de acupuntura de acero inoxidable comercial (0,25 mm × 26 mm) durante todo el estudio. Las agujas se insertaban aproximadamente perpendiculares a la piel hasta una profundidad de 10 mm. Para los grupos de torsión, la rotación bidireccional manual se aplicó suavemente y de forma constante durante 20 minutos durante el periodo de retención por el mismo operador entrenado. La manipulación no estaba controlada por instrumentos; por lo tanto, no se cuantificaron la frecuencia y amplitud exactas de la rotación. Esta limitación ha sido reconocida en la Discusión.
Inicialmente, las agujas se remojaron en una solución de PMMA al 20% (p/v) en MMA, seguidas de secado a temperatura ambiente (25 °C) durante 1 día. A continuación, se realizaron dos hendiduras paralelas de tamaño uniforme y forma y profundidad similares en la capa protectora de PMMA (separadas por 5 mm) utilizando una pequeña hoja de cuchillo artesanal que había sido limpiada con etanol; luego, las agujas se sumergían en ácido sulfúrico de 0,5 M, sirviendo como electrolito durante 10 segundos para someterse a un grabado electroquímico a un voltaje de 12 V, generando así dos ranuras casi circulares en los puntos de marcado. Tercero, tras enjuagar en tres ocasiones, las agujas se sumergieron a temperatura ambiente durante 24 horas en una solución de etanol que contenía 0,1 mol L−1 MPTES y 0,3 mol L−1 APTES, conferiendo así funcionalidad sulfhidril a las superficies ranuradas. Cuarto, el recubrimiento se eliminaba sumergiendo la aguja en MMA. Se prepararon microagujas activas SERS con respuesta al potencial redox basándose en un métodopreviamente reportado 27. El sustrato SERS se adsorció en una de las ranuras grabadas de cada aguja de acupuntura, tras lo cual las microagujas activas en SERS resultantes se sumergieron en una solución acuosa de p-PDA a una concentración de 1 × 10-4 mol/L durante 60 minutos a 37 °C, produciendo microagujas SERS activas y sensibles a la oxidación. Se sintetizaron sustratos SERS basados en nanoconchas de oro como se describióanteriormente en 28. En el trabajo presente, estas microagujas se goteaban en la otra ranura de cada aguja de acupuntura, que luego se dejaban secar de forma natural. Esto produjo microagujas activas en SERS con respuesta de CO y RP.
Evaluación ex vivo de la respuesta de CO y RP a microagujas activas en SERS
Las respuestas de las sondas OC y RP se evaluaron insertando las microagujas activas en SERS en tejido ex vivo. Para verificar la respuesta de la sonda OC a cambios oxidativos, se registraron espectros SERS de p-PDA antes y después de la oxidación. También se adquirieron espectros de las sondas redox SERS en una solución deNaBH 4 fuertemente reductora y una solución de HAuCl4 fuertemente oxidante. La selectividad de la sonda OC se evaluó utilizando agentes reductores, incluyendo 1 × 10-4 MFeSO 4, 1 × 10-4 MNa 2SO4 y 1 × 10-4 M ácido ascórbico, y agentes oxidantes, incluyendo 1 × 10-4 MCuSO 4, 1 × 10-4 M H2O 2, 1 × 10-4 M FeCl3, y 1 × 10-4 MHAuCl 4. Todas las soluciones se prepararon en 20 mM PBS (pH 7,4), y las sondas se incubaron con cada solución durante 20 minutos a 37 °C. La robustez de las microagujas activas en SERS se evaluó registrando las respuestas de CO antes y después de la reacción con 1 × 10-4 mol/L de FeCl3 a temperatura ambiente. Estas pruebas ex vivo y basadas en solución se utilizaron para confirmar la respuesta de la sonda bajo condiciones controladas. Sin embargo, no reproducen completamente la complejidad del microambiente tisular in vivo, donde la variación local del pH, la adsorción de proteínas, los componentes de la matriz extracelular y otras sustancias biológicas pueden afectar a las señales SERS. Por lo tanto, las lecturas in vivo de OC y RP se interpretaron como índices SERS asociados a redox relativos en lugar de mediciones bioquímicas independientes de la matriz.
Detección de OC y RP en sitios de acupuntura y no acupuntura
Para evaluar el rendimiento de las sondas OC y RP en puntos y puntos no acupuntura, se insertaron microagujas activas en SERS en ratas sanas en los puntos ST36 y RN12, y 5 mm adyacentes a cada uno de estos puntos, a una profundidad aproximada de 10 mm, durante el mismo periodo de tiempo.
Efectos de la torsión de aguja en la detección de OC y RP
Para evaluar la respuesta de las sondas OC y RP bajo diferentes técnicas de punción, se insertaron microagujas activas SERS en los puntos de acupuntura ST36 y RN12 y 5 mm adyacentes a estos puntos en ratas sanas hasta una profundidad de unos 10 mm. En cada punto de acupuntura se torcía una aguja, mientras que la aguja correspondiente adyacente al punto no lo estaba, y viceversa (una aguja adyacente al punto de acupuntura se torcía, mientras que su contraparte en el punto de acupuntura no). Las señales SERS de las sondas se recogían al mismo tiempo de inserción para cada aguja.
Cambios en el CO y RP en ratas con IGT respecto a puntos de acupuntura, giro de aguja y condiciones dietéticas
Para evaluar los efectos de los puntos de acupuntura, la torsión de aguja y las condiciones dietéticas sobre el CO y RP de ratas con IGT, las ratas del grupo de dieta alta en grasas fueron asignadas aleatoriamente a tres grupos (A1, A2 y A3; tres ratas en cada grupo), al igual que las del grupo de dieta normal (grupos B1, B2 y B3; tres ratas en cada grupo). En ratas de los grupos A1 y B1, se insertaron microagujas activas en SERS tras la sedación y se torcieron durante 20 minutos; el mismo procedimiento se realizó en ratas de los grupos A2 y B2, salvo que las microagujas se insertaron 5 mm junto a los puntos de acupuntura. En ratas en A3 y B3, las microagujas activas por SERS se insertaron en puntos de acupuntura sin girarlas; Las agujas se dejaron en su sitio durante 20 minutos. La punción se realizaba dos veces al día, a las 10:00 y a las 15:00, durante 7 días. Antes de cada procedimiento diario, se utilizaba un medidor de glucosa para registrar los valores de FPG de cada grupo de ratas (tras ayunar pero sin restricción de agua durante 8 horas). Tras cada día de punción, se midieron y registraron las respuestas de OC y RP. En el día 7, tras acupuntura, se realizó la IPGTT en cada grupo de ratas y se registraron los valores de 2hPG.
Caracterización y medición
La morfología de las microagujas activas en SERS se examinó mediante microscopía electrónica de barrido (MEB). Los espectros SERS se adquirieron a 25 °C, utilizando un espectrómetro Raman configurado con un objetivo de 50× larga distancia de trabajo (NA: 0,5) y un láser de 785 nm. Para todas las mediciones, el tiempo de adquisición fue de 10 s, y el sistema Raman funcionó a una potencia láser nominal de 600 μW bajo la misma configuración óptica. La potencia real del láser entregada en la superficie del tejido no se midió directamente en este estudio. Por ello, los espectros SERS se utilizaron para comparaciones relativas entre grupos bajo idénticos ajustes de adquisición, y no se sacaron conclusiones sobre la seguridad fototérmica absoluta del tejido. Las relaciones de intensidad de dos sondas SERS se calcularon usando el siguiente enfoque: la relación entre los valores de intensidad en 1450 cm−1 y en 1500 cm−1 se designó como indicador para OC (I1450 cm−1/I1500 cm−1), tras restar la intensidad a 1700 cm−1 (como fondo) de cada uno de los dos picos, respectivamente, como en informes anteriores, 17; y usando I1606 cm−1/I1666 cm−1 como indicador de RP, la intensidad en 1700 cm−1 (como fondo ) se restó de cada uno de los dos picos, respectivamente. Los valores calculados deI 1450 cm−1/I1500 cm−1 e I1606 cm−1/I1666 cm−1 se analizaron como índices relativos derivados de SERS de respuestas asociadas a OC y RP, respectivamente. Estas proporciones se usaron para comparar cambios entre grupos y puntos temporales bajo configuraciones idénticas de adquisición.
No se estableció ninguna curva de calibración externa en el presente estudio para convertir estas proporciones en concentraciones absolutas de especies oxidativas o valores absolutos electroquímicos de potencial redox. Cada espectro se registró dos veces en cinco puntos diferentes de la sonda SERS en tres muestras replicadas. Origin se utilizaba para procesar datos y producir gráficos. Para minimizar la variabilidad relacionada con la adquisición, se aplicaron a todos los grupos la misma longitud de onda láser, objetivo, tiempo de adquisición, ajuste de potencia láser y flujo de trabajo de procesamiento espectral. Los posibles efectos fototérmicos o fotoquímicos causados por la irradiación láser no se cuantificaron de forma independiente y se reconocen como una limitación. Los datos estadísticos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM). El tamaño de la muestra y la prueba estadística utilizada para cada experimento o panel de figuras se especifican en las leyendas correspondientes de las figuras. Para experimentos de validación de sondas ex vivo , se utilizaba la sonda SERS o microaguja preparada de forma independiente como unidad de análisis. Para análisis in vivo de glucosa en sangre e índice SERS, se utilizó la rata como unidad de análisis biológico. Los espectros recogidos de múltiples puntos de la misma sonda se trataron como mediciones técnicas y promediaron antes del análisis a nivel de grupo. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS. Se realizaron comparaciones entre grupos utilizando las pruebas estadísticas indicadas en las leyendas de las figuras correspondientes. Las mediciones seriadas de glucosa en ayunas y del índice SERS durante el periodo de intervención de 7 días se interpretaron como tendencias longitudinales exploratorias debido al tamaño pequeño de los subgrupos, y no se aplicó un modelo formal de medidas repetidas ni de efectos mixtos. La significación estadística se definió como p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.
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Los autores declaran no haber conflicto de intereses.
Los autores agradecen al personal de las instalaciones animales y de la plataforma de imagen por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por los principales proyectos de investigación y desarrollo de la provincia de Jiangsu en medicina china (2020ZX05), los proyectos clave de investigación y desarrollo de la provincia de Jiangsu (BE2022684), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Administración Estatal para la Regulación de Mercados (2022MK158) y la fundación de Ciencia y Tecnología de Suzhou (SYW2024031).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A800524 | |
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPTES, 95%) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | M742544 | |
| Ácido ascórbico | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CFAD310554 | |
| Glucosímetro | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe A03 | |
| Tiras de prueba de glucosa en sangre | Cofoe Medical Technology Co., Ltd. | Cofoe-A03-C | |
| Sulfato de cobre (CuSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | PHR1477 | |
| Alcohol etílico (≥99,7%) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW00641752 | |
| Sulfato ferroso (FeSO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | XW01772078701 | |
| Glucosa (Glu) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | D9434 | |
| Peróxido de hidrógeno (H2O2) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | P-17-0500 | |
| Cloruro de hierro (FeCl3) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | CP81015228 | |
| Metacrilato de metilo (MMA) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | M109626 | |
| Espectrómetro micro-Raman | Renishaw | InVia Raman Microscope | |
| p-Fenilendiamina (p-PDA) | Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd. | P128784 | |
| Polimetilmetacrilato (PMMA) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | P742581 | |
| Microscopio electrónico de barrido | Zeiss | ULTRA Plus | |
| Borohidruro de sodio (NaBH4) | Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd. | S432207 | |
| Sulfito de sodio (Na2SO4) | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | S572396 | |
| Agujas de acupuntura de acero inoxidable | Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd. | X-20-03 | |
| Software de análisis estadístico | International Business Machines Corporation | Versión 2021 | |
| Estreptozocina (STZ) | Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd. | S408311 | |
| Ácido tetracloroáurico (HAuCl4) | Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd. | A124024 | |
| Software SPSS | International Business Machines Corporation, Armonk, New York State, USA | versión 26.0 | |
| ratas | Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd. | Macho Sprague-Dawley libre de patógenos específicos | |
| pienso basal | Anuokang Biotech. | SY10001 | |
| Manteca de cerdo | MCE | HY-W127601 | |
| Sacarosa | MCE | HY-B1779 | |
| Polvo de yema de huevo | MCE | HY-B2235B | |
| Ácido cítrico monohidrato | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Citrato de trisodio dihidrato | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Tampon citrato | beyotime | P0086 | |
| Solución salina tamponada con fosfato | beyotime | ST448-1L | |
| Isoflurano | Bioss | D54468 | |
| Sistema de anestesia por isoflurano para animales pequeños | RWD Life Science | R500 | |
| Cámara de inducción y cono nasal | RWD Life Science | Accesorios compatibles R500 | |
| Almohadilla de calentamiento | Shanghai Yuyan Life Science | Y69020 | |
| Etanol al 75% | Boyu Bio. | YB60401 | |
| Cámara de eutanasia con CO2 | Lab Animal Tec. Co. | LAT-10-0090 | |
| WPS | Beijing Kingsoft Office Software | WPS365 |
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