Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Para medir la longevidad en C. elegans, se genera una población sincronizada por edad mediante una puesta de huevos controlada en el tiempo. Se transfieren gusanos hermafroditas adultos activos a placas de medio de crecimiento para nematodos sembradas con E. coli inactivada por UV, se les permite poner huevos durante seis a ocho horas y luego se eliminan. Durante los dos días siguientes, los gusanos eclosionan de estos huevos y crecen hasta el estadio larval L4. Los gusanos L4 se transfieren a nuevas placas NGM que contienen ampicilina para prevenir la contaminación bacteriana viva y FUDR para evitar la reproducción, y se les permite desarrollarse hasta la etapa adulta.

A partir de este momento, los gusanos adultos se observan cada dos o tres días hasta que todos los gusanos hayan muerto. En cada punto temporal, se retiran los gusanos muertos de la placa y se registra el número de gusanos vivos y muertos. Soy George Seton del laboratorio de Matt Capline en el Departamento de Patología de la Universidad de Washington.

Hoy les vamos a mostrar cómo medir la longevidad y observar nuestra elegancia hepática. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la genética del envejecimiento. Así que comencemos.

Un experimento básico de duración de vida requiere dos tipos de placas: placas NGM estándar, que no contienen aditivos, y placas AMP FUDR, que tienen añadidos ampicilina y fluorodesoxiuridina al NGM. Ambos tipos de placas se siembran con bacterias e coli OP 50, que posteriormente se inactivan mediante exposición a UV. Comience preparando 10 mililitros de solución de NGM.

Por cada placa de Petri de 60 milímetros, derrita completamente el NGM sólido en el microondas a potencia máxima en pulsos de 32 segundos. Agite el medio entre pulsos para evitar la acumulación de burbujas de gas presurizado; coloque el NGM líquido en un baño de agua a 55 grados Celsius o sobre la bancada para permitir que el medio se enfríe. Una vez que el medio haya enfriado a 55 grados Celsius, temperatura a la cual debería poder sostener el recipiente de vidrio con las manos desnudas cómodamente, estará listo para agregarle los fármacos.

Y para verter las placas con fármacos, añada 33 microlitros de FUDR 150 milimolar y 100 microlitros de ampicilina al 100 miligramos por mililitro por cada 100 mililitros de NGM y agite suavemente para mezclar. La ampicilina se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana externa y el FUDR para impedir que los huevos eclosionen, de modo que los gusanos no necesiten ser transferidos cada pocos días con el fin de separarlos de las larvas en crecimiento.

Ahora vierta el medio y deje secar las placas sobre la bancada durante dos días. El día anterior a que las placas terminen de secarse, siembre un cultivo líquido de LB con una colonia aislada de una siembra fresca de e coli. OP 50 bacterias en agar LB. Prepare al menos 0,5 mililitros de cultivo por placa de 60 milímetros.

Coloque el cultivo OP 50 en un agitador a 37 grados Celsius y deje crecer las bacterias durante la noche. Al día siguiente, pelletice las bacterias OP 50 con una fuerza centrífuga de 3.500 × g durante 10 minutos. Deseche por decantación la cantidad suficiente del sobrenadante para resuspender las bacterias a una concentración 10 ×.

Ahora inocule cada placa con 100 microlitros de la cultura concentrada. Evite tocar la superficie del NGM con la punta de la pipeta, ya que imperfecciones en la superficie del medio permitirían que los gusanos se entierren. Gire las placas hasta que las bacterias cubran la zona central del NGM sin acercarse a las paredes de la placa y deje las placas secar sobre la bancada durante 24 horas. Una vez secas, exponga la superficie de las placas a una dosis de UV suficientemente fuerte como para detener el crecimiento bacteriano; utilizamos un estratagema UV straddle linker 2, 400.

Comience cargando las placas en el enlazador de tipo straddle sin sus tapas. Ahora presione energía. Ingrese 9 9 9 9 en el teclado numérico y presione inicio.

Las placas se expondrán a UV durante aproximadamente cinco minutos. Las placas con bacterias muertas por UV se pueden almacenar boca abajo a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Esta sección describe cómo generar una población de gusanos con una fecha de eclosión común.

Comience transfiriendo aproximadamente 20 gusanos adultos jóvenes a una placa NGM fresca sin fármacos. Deje la placa a 25 grados Celsius durante aproximadamente una semana para permitir que los gusanos se propaguen y consuman toda la comida bacteriana en una semana. Deben aparecer gusanos recién eclosionados en la etapa de crecimiento arrestado de dauer; transfiera 20 a 30 larvas de dauer a una placa NGM fresca sin fármacos e incúbelas a 25 grados Celsius en presencia de alimento.

Las larvas adultas se volverán reproductivamente activas dentro de dos días y permanecerán activas reproductivamente durante unos días más. Ahora transfiera de 10 a 15 adultos reproductivamente activos a una placa fresca de NGM sin fármacos. Esta placa se denomina placa de puesta de huevos programada o placa TEL.

Deje la placa TEL a 25 grados Celsius para que los gusanos pongan huevos. Los animales que eclosionen de estos huevos serán los animales experimentales y se evaluará su longevidad después de seis horas. Inspeccione la placa TEL en busca de huevos.

Si aún no hay suficientes huevos, deje la placa TEL a 25 grados Celsius durante un máximo de 24 horas en total. Revise periódicamente la presencia de huevos. Cuando se haya depositado un número suficiente de huevos, retire los adultos de la placa TEL.

Un experimento típico de longevidad requerirá de 30 a 90 huevos por grupo experimental, pero se pueden generar varios cientos de huevos en una sola placa TEL. Aproximadamente 150 huevos serán puestos por 10 a 15 adultos reproductivamente activos en seis a ocho horas. Al comparar grupos experimentales, puede alcanzarse significancia estadística para diferencias grandes en longevidad con tan solo 30 animales.

Se deberían utilizar más animales para distinguir diferencias más modestas. Ahora, coloque la placa TEL sin adultos a 20 grados Celsius hasta que los huevos eclosionen y los gusanos hayan desarrollado hasta el estadio larval L4. Esto generalmente tarda dos días para el tipo salvaje C. elegans, pero puede tardar más en cepas con fenotipos de desarrollo lento.

Esta sección describe cómo seguir la vida de una población sincronizada por edad. Primero, transfiera las larvas L4 desde la placa TEL a placas AMP FUDR preparadas. Para cada cepa o condición que se pruebe, es habitual preparar de dos a tres placas con entre 25 y 30 gusanos por placa.

Incubar las placas AMP FUDR a 20 grados Celsius durante 24 horas. Luego evaluar visualmente los gusanos, el medio y la bacteria, y transferir los gusanos a placas AMP FUDR frescas. Si los gusanos han consumido la mayor parte del alimento bacteriano, esto generalmente ocurrirá una o dos veces por semana.

Al principio del experimento, si hay un número significativo de larvas presentes, esto generalmente indica que los gusanos se transfirieron a las placas con AMP y FUDR como adultos jóvenes en lugar de como L4. Los adultos jóvenes pueden poner huevos antes de que el FUDR haga efecto, y ocasionalmente las larvas escapan a los efectos del FUDR y crecen hasta convertirse en adultos. Estas larvas alterarán el experimento en esta situación; transfiera los gusanos adultos a placas nuevas y deseche las placas antiguas que contengan las larvas.

Los gusanos también deben transferirse a placas frescas si se observan bacterias vivas en crecimiento. Por lo general, la combinación de AMP y eliminación mediante UV garantizará que ninguna bacteria viva contamine el experimento, aunque ocasionalmente puede ocurrir. Asimismo, transfiera los gusanos.

Si se observa crecimiento fúngico en el medio. Si se detecta a tiempo, el hongo puede eliminarse utilizando la punta de una pipeta o una espátula. Una vez que crece hasta alcanzar un diámetro mayor de unos pocos milímetros, generalmente es más sencillo transferir los gusanos a una placa nueva.

Evalúe la longevidad de todos los gusanos cada dos o tres días. Utilizando un microscopio estereoscópico, determine si cada gusano está vivo o muerto.

Toque suavemente la placa. El gusano está vivo si se mueve en respuesta al golpeteo. Si el gusano no responde al golpeteo de la placa, acerque la imagen a la región de la cabeza y toque suavemente la cabeza del gusano con una aguja de platino para transferencia.

Califique al gusano como muerto. Si no responde moviendo su cabeza, retire al gusano muerto de la placa. Después de revisar todos los gusanos, registre la fecha y el número de gusanos que están vivos y muertos.

Los gusanos mantenidos en medio sólido escaparán ocasionalmente de la superficie de la placa al excavar o arrastrarse por la pared. Los gusanos que huyen se omiten por completo del estudio. Una vez finalizado, devuelva las placas al incubador a 20 grados Celsius.

Espere otros dos o tres días y luego revise nuevamente las placas. Continúe con este régimen hasta que todos los gusanos hayan muerto. El número de gusanos que mueren cada día se invierte típicamente para calcular la proporción de gusanos vivos en cada día; estos datos se representan gráficamente como una curva de supervivencia con respecto al día de la puesta de huevos programada.

Día cero. La vida media típica para N. two. La cepa silvestre Sea elgan mantenida en bacterias inactivadas por UV a 20 grados Celsius es aproximadamente de 25 días, medida a partir del huevo.

Acabamos de mostrarle cómo medir la longevidad y observar la elegancia. Puede modificar este procedimiento básico para probar una variedad de condiciones ambientales, incluyendo la restricción dietética y la interferencia por ARN, que se discuten en el texto complementario. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con su experimento.