Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Este procedimiento comienza con el cultivo de la cepa cebo en un medio que contiene aminoácidos normales en la cepa control SLAC y lisina y arginina con isótopos pesados. Se mezclan cantidades iguales de ambas cepas y se lisaron mediante trituración y nitrógeno líquido. Los lisados crudos, primero se pelletaron por centrifugación y luego se clarificaron mediante unión a perlas esféricas. A continuación, el lisado celular se une a perlas de IgG.

Las proteínas unidas a las perlas de IgG se eluyen mediante proteasa, escisión y precipitación. La muestra ya está lista para su análisis mediante espectrometría de masas. Hola, soy Jesse Chao del Laboratorio Lone del Departamento de Biología Celular y Ambiental del Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Columbia Británica.

Hoy les mostramos un procedimiento para el análisis proteómico cuantitativo denominado silak, combinado con purificación por afinidad. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar complejos proteicos.

Así que comencemos. En este procedimiento, la cepa cebo contiene aminoácidos normales, mientras que la cepa control SLAC contiene lisina y arginina con isótopos pesados. Para comenzar, primero cultive un litro de la cepa cebo y un litro de la cepa control por separado, hasta alcanzar el valor que se muestra en su pantalla. A continuación, vierta el cultivo en tubos de centrífuga Nalgene de 500 mililitros.

Equilibre la carga en las células del pellet a 2.580 RCF, deseche el medio y re suspenda el pellet. Con 50 mililitros de H2O fría, mientras transfiere las células a tubos cónicos de 50 mililitros, centrifugue los tubos para obtener el pellet celular a 3.000 RCF. En este punto, puede congelar el pellet a -80 grados Celsius.

Es importante recordar que se debe emparejar la cepa de control con la cepa cebo uno a uno según el peso seco del pellet. ReSuspender cada pellet celular en 10 mililitros de tampón NP-40 con una proporción de uno a 2000 de una mezcla de inhibidores de proteasas. Mezclar las dos cultivos celulares vertiendo directamente un tubo en el otro.

Para comenzar a moler las células, vierta primero nitrógeno líquido en el mortero previamente enfriado y deje que se evapore completamente. A continuación, agregue dos mililitros de células al mortero. Vierta algo de nitrógeno líquido para congelar las células.

Muela las células hasta que se conviertan en un polvo fino. Repite el proceso hasta que todas las células hayan sido molidas. Asegúrate de no permitir que las células se descongelen.

Añada nitrógeno líquido cuando sea necesario. A continuación, transfiera el polvo a un vaso de precipitados frío con hielo y descongele a temperatura ambiente. Cuando los bordes comiencen a descongelarse, agregue 20 mililitros de tampón NP-40 con un PIC de uno a 200 después de que se haya descongelado.

Transfiera el lisado crudo a tubos Nalgene de 40 mililitros y centrifugue a 16.000 RPM en un rotor Sovos SA 600 durante 30 minutos. Mientras tanto, tome 300 microlitros de los SROs dos B y lave los corpúsculos con 300 microlitros de tampón NP-40 tres veces. A continuación, re suspenda los corpúsculos en 300 microlitros de tampón para que queden en una suspensión uno a uno.

El siguiente paso consiste en preclear el lisado celular. Para ello, primero transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y agregue las perlas Spheros two B. Incube en una plataforma rotatoria en cámara fría durante 30 minutos.

Mientras se incuba, tomar 300 microlitros de SRO de IgG con seis perlas y lavar las perlas tres veces con 300 microlitros de tampón NP-40. A continuación, resuspender las perlas en 300 microlitros de tampón para obtener una suspensión en proporción uno a uno. Tras la incubación, centrifugar los SRO para formar un precipitado.

Dos perlas en. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. Recuerde guardar una alícuota del lisado celular para la inmunotransferencia más adelante.

Luego agregue las perlas de IgG. Separe el contenido en dos tubos para una unión más eficiente, incube en una plataforma rotatoria en un cuarto frío durante dos horas. Después de la incubación, recoja las perlas en una columna de cromatografía a cuatro grados Celsius.

Asegúrese de guardar una alícuota de la fracción no ligada. Lave las perlas con 10 mililitros de tampón NP 40.

A continuación, lave las perlas con tres mililitros de tampón TEVC. Nuevamente, recuerde guardar una alícuota de las perlas.

Esto reflejará la eficiencia de unión para eluir las perlas. Primero, agregue cinco microlitros de A-C-T-E-V a un mililitro de tampón TEVC. Añada tampón TEVC a las perlas y mezcle.

Transfiera el contenido a dos tubos EINOR de 1,5 mililitros para una mezcla más eficiente e incube durante la noche en una plataforma rotatoria dentro de un cuarto frío. A continuación, centrifugue para sedimentar las perlas y transfiera el eluato a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Lave las perlas con 0,5 mililitros adicionales de tampón TEVC tras el lavado.

Combine los ocho en un solo tubo. Debe tener 1,5 mililitros de ELU ocho en total. Guarde una alícuota del TEV Elu ocho para precipitar.

Ajuste las alícuotas a TCA al 25 % con TCA al cien por cien. Para hacerlo, separe el LU ocho de 1,5 mililitros en dos tubos de 750 microlitros cada uno. Añada 250 microlitros de TCA al 100 % al tubo.

Su solución debería volverse turbia. A continuación, colóquela en hielo durante 30 minutos. Agite periódicamente la mezcla mediante vórtex tras la incubación.

Centrifugar a máxima velocidad en una centrífuga de banco en una sala fría durante 30 minutos. Lavar una vez con 500 microlitros de acetona fría con hielo que contenga ácido clorhídrico 0,05 N. Luego centrifugar durante cinco minutos a máxima velocidad a cuatro grados Celsius.

A continuación, lave una vez con 500 microlitros de acetona fría con hielo y centrifugue durante cinco minutos a velocidad máxima a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente la acetona y seque el precipitado para la tinción con plata. Re suspenda el precipitado en 50 microlitros de tampón de muestra SDS una vez.

Si planea utilizar la proteína precipitada para un análisis basado en espectrometría de masas, entonces se recomienda realizar la precipitación usando etanol. Para ello, primero agregue 20 microgramos de glicógeno, luego diluya las muestras cinco veces con etanol al cien por ciento y ajuste a 50 milimolares de bicarbonato de sodio con un stock de 2,5 molares a pH 5,0. Mezcle la solución invirtiendo el tubo.

Déjelo reposar durante dos horas a temperatura ambiente. Finalmente, divida el contenido en dos tubos eppendorf. Pelote la proteína precipitada mediante centrifugación durante 10 minutos a 12,000 ×g a temperatura ambiente.

La alícuota guardada durante el procedimiento de purificación debe incluir el lisado celular pre-limpiado, la fracción retenida, la fracción no retenida y la fracción eluida. Recomendamos analizar el contenido proteico de las alícuotas mencionadas mediante inmunotransferencia usando anticuerpo Antit TAP o tinción con plata para reflejar la eficiencia de unión y elución del experimento. En este gel teñido con plata, se visualizó y comparó la SCS purificada con doble etiqueta TAP junto con sus proteínas interaccionantes frente a un control sin etiqueta en esta inmunotransferencia.

Se analizaron varias fracciones obtenidas durante la purificación de SCS two tap mediante inmunotransferencia con el anticuerpo Antit tap. Obsérvese que SCS two tap migró con un peso molecular menor tras la elución mediante escisión con la proteasa TEV, y no quedó ninguna SCS two tap en las perlas de IgG después de la elución. Esto confirmó que la purificación fue altamente eficiente.

Acabamos de mostrarle cómo purificar complejos proteicos mediante purificación por afinidad con perlas de IgG. Al realizar este procedimiento, es importante recordar asegurarse de igualar la cepa base y la cepa control por peso seco del pellet antes de comenzar el procedimiento de purificación. Dado que LAC nos proporciona mediciones imparciales y emparejadas de las proteínas asociadas por unión, solo llevamos a cabo la primera etapa de la purificación TAP para minimizar la pérdida de muestra.

Si experimenta cantidades significativas de unión inespecífica, es posible que desee llevar a cabo todo el protocolo, que puede encontrarse en el manual de Cold Springing Harbor. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.

Oye, vamos, Mark. Ah, ve.