Lote de inmunotinción para la detección de proteínas a gran escala en el cerebro del mono entero
27 de julio de 2009
A gran escala inmunodetección de las proteínas diana a través del cerebro de los primates todo es posible mediante el empleo de tejidos novedosos métodos de inclusión y corte en combinación con el uso de aparatos creativas para la tinción de lotes de varias secciones de flotación libre en un momento dado.
Este procedimiento comienza al recibir un cerebro perfundido con PFA al 4%, externalizado y crioprotegido, que ha sido enviado a asociados en neurociencia para su inclusión utilizando referencias de alineación incrustadas en la matriz circundante. El cerebro puede seccionarse en el plano coronal para producir secciones seriadas de un grosor deseado, las cuales representarán toda la extensión anteroposterior del cerebro mediante el uso de cestas y contenedores especializados. Puede realizarse un procesamiento inmunoquímico por lotes con el fin de determinar el patrón de expresión espacial de una proteína en todo el cerebro.
Hola, soy la Dra. Shaheen Zur del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hola, soy el Dr. Mark Burke, también del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hola, soy el Dr. Mo Petto, director del Laboratorio de Neurociencia Visual de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal.
Hoy les mostraremos un procedimiento de inmunotinción en lote para la detección a gran escala de proteínas en un cerebro completo de mono. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los patrones de expresión de proteínas diana en todo el cerebro y para comparar y contrastar la expresión de esas proteínas dentro del mismo cerebro. Así que comencemos.
Antes del procesamiento histológico, obtenga un cerebro de primate que se haya conservado mediante perfusión sistémica y fijación posterior, y protegido mediante congelación usando soluciones de sacarosa en gradiente. En esta etapa, el cerebro se envía a neuroscience associates para que sea incluido y seccionado libremente mediante su tecnología patentada. Al recibirlo de regreso, se observará que siete puntos de referencia de alineación han sido colocados en la matriz de inclusión para que las secciones puedan orientarse adecuadamente y reajustarse tras completar el procesamiento histológico.
Mientras se realiza el corte, se toman imágenes digitales que luego pueden utilizarse para la reconstrucción 3D de mapas anatómicos. Neuroscientist Associates procesa nuestro tejido para obtener cortes coronales seriados de 50 micrómetros de grosor, libres en solución, que abarcan todo el cerebro. Una vez completado este paso, podemos comenzar el procesamiento histológico de los cortes.
Cuando comenzamos el procesamiento histológico, normalmente manejamos alrededor de 140 cortes por anticuerpo o tinción. Aquí demostraremos la técnica con una muestra más pequeña de cortes tratados con el anticuerpo SMI 32, que es un anticuerpo monoclonal contra proteínas de neurofilamentos no fosforiladas. A lo largo del procedimiento, se utilizan platos y canastillas especiales para tinción, lo que permite procesar simultánea y eficientemente un gran número de cortes en estado libre flotante.
Esto asegura que la tinción resultante sea consistente en todas las secciones. El primer paso consiste en incubar las secciones en una solución basada en PBS que contiene TRITON X-100 y suero de caballo normal durante 60 minutos. Esto reducirá la unión inespecífica de las moléculas de anticuerpo que provoca una tinción de fondo.
A continuación, se incuban los cortes durante la noche. En una solución de anticuerpo SMI 32 basada en PBS, suplementada con Triton X 100 y suero de caballo normal, al día siguiente se lavan los cortes durante tres períodos de 10 minutos en solución de lavado y luego se incuban durante dos horas a temperatura ambiente en una solución de anticuerpo secundario biotinilado Muse basada en PBS, que contiene Triton X 100 y suero de caballo normal.
Después de un conjunto adicional de tres lavados de 10 minutos cada uno, las secciones se colocan en una solución del complejo de avidina-biotina conjugado con peroxidasa de rábano picante durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, tras otro conjunto de lavados, las secciones se colocan en una reacción con diaminobencidina durante 10 minutos, lo que produce una tinción marrón en las neuronas inmunorreactivas. La reacción se detiene entonces retirando la canasta de tinción e inmersando las secciones en PBS.
Después de dos o tres enjuagues de cinco minutos en PBS, las secciones están listas para ser montadas individualmente sobre portaobjetos de vidrio para iniciar el proceso de montaje, utilizando una placa de Petri grande y pinceles de pintura muy suaves. Las secciones se levantan del recipiente con tampón PBS y se montan individualmente sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina. Luego, las muestras se dejan secar al aire durante la noche en una campana extractora al día siguiente.
Las secciones se enjuagan sumergiéndolas en agua desionizada para eliminar cualquier cristal de sal que pueda haber quedado del proceso de montaje. Luego, las preparaciones se deshidratan mediante pasos graduados de etanol, se limpian con xileno y se cubren con un medio de montaje tipo Permount. En esta etapa, las preparaciones deben almacenarse durante aproximadamente una semana a diez días en posición horizontal para permitir que el medio de montaje se endurezca.
Después de esto, los portaobjetos pueden almacenarse en una caja para portaobjetos o someterse a imágenes mediante microscopía. Este método produce un perfil completo de expresión de una proteína diana de interés en todo el cerebro de mono. Aquí mostramos secciones coronales representativas que proporcionan una instantánea de la expresión de FMRP, nueva n y SMI 32.
En el mismo cerebro de mono. Acabamos de mostrarle cómo realizar la inmunotinción por lotes para una proteína diana de interés en todo el cerebro. Al realizar este procedimiento, es importante asegurarse de que todas las secciones sufran una agitación suave mientras se incuban en diversas soluciones, y de que en todo momento permanezcan completamente sumergidas.
Además, tómese su tiempo al montar en vidrio las disecciones y elimine tantas arrugas y pliegues como sea posible sin dañar la integridad del tejido. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo describe un enfoque novedoso para la inmunodetección a gran escala de proteínas diana en todo el cerebro de primates. Destaca métodos innovadores de inclusión y corte de tejidos, junto con técnicas de tinción en lote para múltiples secciones libres flotantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Inmunodetección
- Imagen cerebral
Antecedentes
- La inmunodetección es fundamental para estudiar la expresión proteica en el cerebro.
- Los métodos tradicionales pueden tener limitaciones en cuanto a alcance y eficiencia.
- Los avances en las técnicas de procesamiento de tejidos pueden mejorar las capacidades de investigación.
- El procesamiento por lotes permite un análisis integral de la distribución de proteínas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar métodos para la inmunodetección a gran escala en cerebros de primates.
- Mejorar la eficiencia del análisis de expresión de proteínas.
- Facilitar el estudio de los patrones de expresión espacial en todo el cerebro.
Métodos Utilizados
- Perfusión con PFA al 4 % para la preservación del cerebro.
- Inclusión utilizando referencias de alineación en una matriz circundante.
- Seccionamiento en el plano coronal para obtener secciones seriadas.
- Procesamiento inmunológico por lotes para el análisis espacial de la expresión proteica.
Resultados principales
- Embebido y seccionado exitoso de tejido cerebral de primates.
- Capacidad demostrada para analizar patrones de expresión proteica.
- Técnicas innovadoras que mejoran la eficiencia de la inmunodetección.
- Potencial para aplicaciones más amplias en la investigación en neurociencia.
Conclusiones
- Los métodos desarrollados mejoran significativamente la inmunodetección a gran escala.
- Estas técnicas pueden avanzar nuestro entendimiento sobre la expresión de proteínas en el cerebro.
- La investigación futura puede basarse en estos métodos para diversas aplicaciones.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cartografía a gran escala de la expresión proteica en cerebros de primates apoya la validación de objetivos terapéuticos y la reducción del riesgo mecanicista en el descubrimiento de fármacos en neurociencia. La inmunotinción por lotes permite una evaluación reproducible y cuantitativa de la distribución espacial de proteínas en todo el cerebro, mejorando la confianza predictiva sobre el acoplamiento al objetivo y la modulación de vías. Este enfoque aborda una brecha crítica en la investigación traslacional al proporcionar datos del sistema relevantes para la enfermedad, útiles para la identificación de compuestos líderes y la alineación de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la localización de la expresión de proteínas diana en todo el cerebro de primates.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la tinción uniforme de cortes seriados para una evaluación consistente del acoplamiento al objetivo.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al proporcionar datos espacialmente resueltos de expresión proteica para tomar decisiones de avance o interrupción.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el procesamiento por lotes de secciones libres.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante la inmunotinción sincronizada de grandes conjuntos de secciones.
- Valor estratégico: Destaca la preparación para cribado y la reutilización de plataformas para la evaluación confiable de compuestos en líneas de descubrimiento.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la correlación de los patrones de expresión proteica con modelos de trastornos neurológicos.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica utilizando protocolos estandarizados de inmunotinción.
- Valor predictivo: Aborda las decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la medición cuantitativa de los niveles de proteínas y de las poblaciones neuronales.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la investigación preclínica, al permitir el análisis de expresión proteica con resolución espacial en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la cartografía proteínica de todo el cerebro.
- Selección: Describe la disponibilidad y reproducibilidad del ensayo mediante inmunotinción por lotes de secciones seriadas.
- Análisis: Destaca lecturas cuantitativas, como niveles de proteínas y conteos de poblaciones neuronales, para el análisis comparativo de condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el método con la continuidad preclínica mediante la alineación de patrones de expresión con estudios de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para la detección a gran escala de proteínas en múltiples dianas y estudios.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en estudios de expresión proteica.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de inmunotinción para conjuntos grandes de secciones.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la eliminación temprana del riesgo del objetivo.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en perfiles de expresión de todo el cerebro.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en histología, inmunohistoquímica y neuroanatomía.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo platos y cestas especializadas para tinción, así como sistemas de microscopía.
- Requisitos de estandarización entre equipos para el alineamiento de secciones, la consistencia de la tinción y la interpretación de datos.
- Consideraciones de adaptación entre sistemas modelo, particularmente para el procesamiento de cerebros de primates frente a roedores.
- Limitaciones prácticas, incluyendo la complejidad del manejo de secciones y la precisión requerida en el montaje de secciones seriadas a gran escala.
