Técnicas de microinyección para el estudio de la mitosis en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial
15 de septiembre de 2009
Este protocolo describe el uso de la microinyección y la imagen de alta resolución en el Drosophila melanogaster Embrión sincitial para estudiar mitosis.
Este procedimiento comienza con la recolección de embriones en placas con jugo de uva fresco durante 30 a 60 minutos. Después de retirar la placa de la jaula del lago, recoja los embriones con un pincel humedecido y colóquelos sobre cinta adhesiva doble. Ruede suavemente un embrión sobre la cinta utilizando una mitad de una pinza hasta que el corion se abra.
Recoge el embrión y colócalo suavemente sobre la cubierta. Coloca una capa de pegamento het encima. Repite este procedimiento hasta que tengas suficientes embriones.
Tras la deshidratación, los embriones están listos para la inyección. Hola, soy Ingrid Bruce Musher del laboratorio del Dr. Jonathan Sculley en el Departamento de Biología Molecular y Celular de la Universidad de California en Davis. Hoy les mostraremos un procedimiento para microinyectar embriones sincitiales de Drosophila.
Utilizamos este procedimiento para estudiar el papel de los microtúbulos y los motores basados en miosina en la mitosis. Por ejemplo, inyectamos microscópicamente anticuerpos u otros inhibidores de proteínas mitóticas específicas. Al analizar el efecto del inhibidor sobre la mitosis, podemos determinar la función de las proteínas diana.
Así que comencemos. Para iniciar los preparativos dos o tres días antes del experimento, prepare la jaula de puesta cortando dos orificios pequeños de aproximadamente un centímetro cuadrado en lados opuestos de una botella de plástico. Rellene los orificios con un trozo de algodón, permitiendo que circule el aire.
Toque la botella para hacer caer las moscas y luego cúbrala con una placa de jugo de uva. Con levadura, mantenga la jaula de las patas a temperatura ambiente; las moscas pondrán huevos durante hasta 10 días, al menos un día antes del experimento. Prepare las agujas para inyección y manténgalas a cuatro grados Celsius.
El día del experimento, prepare y cargue las agujas. Primero, retire la tubulina etiquetada del congelador y colóquela en hielo durante cinco a 15 minutos. A continuación, dilúyala con tampón GPEM y luego centrifúguela de 10 a 15 minutos a 13.000 RPM a cuatro grados Celsius.
Finalmente, cargue de uno a dos microlitros en la aguja y manténgala a cuatro grados Celsius para prevenir la polimerización inducida por la temperatura en la aguja. Antes de colocar la cubreobjetivo, prepare pegamento de heptano enrollando cinta adhesiva doble y colocándola en un frasco de 100 mililitros.
Agregue aproximadamente 50 mililitros de heptano, selle el frasco y agítelo durante varios días. Antes de preparar los embriones, prepare una cámara de deshidratación en la que se colocarán los embriones antes de la inyección. Para ello, coloque una parte de una placa de 35 milímetros dentro de una placa de Petri de 100 milímetros para hacer una mesa, agregue desecante, a la derecha, que sea sulfato de calcio anhidro alrededor, de modo que la altura del desecante a la derecha no sea mayor que la de la mesa, y cúbrala.
Para comenzar la preparación de los embriones, primero recóctalos de la jaula lacustre cambiando la placa de jugo de uva con levadura cada hora; los embriones deben observarse aproximadamente dos horas después del inicio de la recolección. Para preparar la cubreobjetivo, colócala en un lado de un portaobjetivo y sujeta las cuatro esquinas con cinta para que no se mueva. Utilizando un aplicador de algodón, coloca una capa de cola de heptano en forma de línea sobre la cubreobjetivo.
El pegamento no debe ser viscoso y debe secarse en unos pocos segundos. Si es demasiado espeso, agregue más heptano. Finalmente, coloque un trozo de cinta adhesiva doble cara en el portaobjetos junto a la cubreobjetos.
Deslice con un pincel humedecido. Retire cuidadosamente los embriones de la placa de jugo de uva y colóquelos sobre la cinta adhesiva doble cara del portaobjetos. A continuación, utilice una de las puntas de una pinza para rodar los embriones sobre la cinta adhesiva doble cara hasta que el corion se abra.
Recoger el embrión girándolo suavemente sobre el Corian para que se adhiera a la pinza y colocarlo sobre el pegamento de heptano en la cubierta. Colocar con el lado largo del embrión paralelo al lado largo de la cubierta. Colocar de 10 a 20 embriones en una fila.
Retire el cubreobjetos y colóquelo en la cámara de deshidratación durante tres a ocho minutos. El tiempo depende de la humedad local y de la cantidad que se va a inyectar. A continuación, coloque el cubreobjetos sobre una cámara metálica con grasa al vacío.
Finalmente, cubra los embriones con aceite de halo carbono para evitar una mayor deshidratación. Los embriones ya están listos para la inyección. Primero, localice los embriones bajo un objetivo de 16 x.
Mueva los embriones hacia un lado y localice la aguja sin mover el plano focal. Centre la aguja y muévala hacia arriba sin desplazarla en la dirección X o Y. Para abrir la aguja, coloque el borde del cubreobjetos en el campo de visión, pero no en el lugar donde estará la aguja.
Y baje la aguja hasta el mismo plano focal. Mueva con mucho cuidado la laminilla hasta que toque la aguja y la rompa suavemente. Suba la aguja.
Ahora coloque los embriones a la vista. Introduzca la aguja en el aceite y asegúrese de obtener gotas de líquido bien definidas de la punta de la aguja. Mueva el embrión hacia la aguja de forma constante, inyecte una gota dentro del embrión y luego retire el embrión.
Después de que se hayan inyectado todos los embriones, están listos para ser observados en un microscopio confocal con un objetivo de 60 o 100 x. Un embrión control debería verse como el que aparece en esta película. Este es un embrión que expresa tubulina GFP e histona RFP, capturado con un objetivo de 100 x en un microscopio confocal de disco giratorio.
El tiempo total mostrado es de ocho minutos. Las gráficas de la distancia de polo a polo son muy reproducibles y constituyen una medida confiable del éxito en embriones control. Deberían verse como las mostradas aquí para los ciclos 11 a 13.
En esta película se muestra otro embrión control. Este expresa KLP 61 FGFP y fue inyectado con tubulina r Domine. También fue observado con un objetivo de 100 x en un microscopio confocal de disco giratorio, y el tiempo total es de siete minutos.
Esta película se obtuvo inmediatamente después de la microinyección, y el gradiente en la concentración de tubulina r Domine es claramente visible al inicio del video. Estos embriones pueden utilizarse para estudiar la inhibición de Klp 61 F tras la microinyección del anticuerpo contra Klp 61 F. Podemos observar la pérdida de Klp 61 FGFP de los husos.
Acabamos de mostrarle cómo microinyectar embriones de Drosophila con incisión. Al realizar este procedimiento, es importante recordar realizar controles, primero practicar inyectando tampón o rutina solamente, y asegurarse de que la mitosis avance normalmente a través de la fase celular. Una vez que todas sus inyecciones sean confiables y no causen daño, puede inyectar un inhibidor y estudiar el efecto de esa inhibición particular.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este protocolo describe el uso de microinyección y de imágenes de alta resolución en el embrión sincicial de Drosophila melanogaster para estudiar la mitosis. El procedimiento implica un manejo cuidadoso de los embriones para garantizar un análisis y una visualización exitosos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Biología celular
Antecedentes
- Drosophila melanogaster es un organismo modelo ampliamente utilizado en la investigación biológica.
- Comprender la mitosis es fundamental para obtener conocimientos sobre la división celular y el desarrollo.
- Las técnicas de imagen de alta resolución mejoran la observación de los procesos celulares.
- La microinyección permite la manipulación precisa de embriones con fines experimentales.
Objetivo del estudio
- Investigar la dinámica de la mitosis en embriones de Drosophila.
- Utilizar técnicas avanzadas de imagen para la observación celular detallada.
- Establecer un protocolo confiable para estudios futuros en biología del desarrollo.
Métodos Utilizados
- Recolección de embriones en placas con jugo de uva.
- Microinyección de embriones para manipulación experimental.
- Imagen de alta resolución para observar procesos mitóticos.
- Manejo cuidadoso de los embriones para prevenir daños durante la preparación.
Resultados principales
- Visualización exitosa de las etapas mitóticas en embriones de Drosophila.
- Se demostró la eficacia de las técnicas de microinyección.
- Proporcionó información sobre el momento y la regulación de la división celular.
- Se estableció un marco para investigaciones futuras sobre el desarrollo embrionario.
Conclusiones
- El protocolo es efectivo para estudiar la mitosis en embriones de Drosophila.
- La obtención de imágenes de alta resolución es crucial para comprender la dinámica celular.
- Este estudio contribuye al campo más amplio de la biología del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la interrogación funcional de proteínas mitóticas en un sistema in vivo rápido y sincrónico, que apoya la validación de objetivos mediante lecturas fenotípicas de la inhibición proteica. El embrión sincicial de Drosophila proporciona un sistema relevante para enfermedades destinado a la reducción mecanicista de riesgos de objetivos mitóticos, permitiendo la evaluación de la función proteica antes de la identificación del compuesto líder. La imagen cuantitativa de la dinámica del huso ofrece una confianza predictiva sobre la esencialidad del objetivo y su participación en la vía.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de fenotipos de pérdida de función a través de microinyección de anticuerpos específicos para proteínas.
- Valor operativo: Apoya la desactivación del riesgo biológico mediante series fenotípicas dependientes de gradiente que se asemejan a mutantes alélicos.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de la confianza en el blanco al correlacionar la intensidad de la inhibición con la gravedad del defecto mitótico.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Genera lecturas estandarizadas y reproducibles de la mitosis (distancia de polo a polo) para la selección de compuestos o inhibidores.
- Resultado cuantitativo: Proporciona puntos finales medibles basados en imágenes, que permiten el análisis de respuesta frente a dosis de la inhibición de proteínas.
- Escalabilidad: Permite la preparación e imagen paralela de embriones para la validación funcional de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: La conservación del aparato mitótico apoya la alineación translacional de biomarcadores con las vías de división celular humana.
- Continuidad preclínica: Permite el seguimiento mecanicista desde hallazgos genéticos hasta la validación funcional en un sistema vivo.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Ayuda a priorizar objetivos basándose en la penetrancia fenotípica y la especificidad de la inhibición.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento para validar dianas mitóticas antes de las etapas de desarrollo de ensayos y de identificación de compuestos activos, aprovechando la funcionalidad in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la validación funcional de dianas mediante la perturbación directa de proteínas mitóticas.
- Tamizaje: Permite la preparación de ensayos mediante lecturas estandarizadas y cuantificables de imágenes mitóticas.
- Análisis: Proporciona mediciones objetivas basadas en imágenes (por ejemplo, longitud del huso) para comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos a través de mecanismos mitóticos conservados y la conservación de la función proteica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la validación iterativa de dianas en múltiples reguladores mitóticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la función del blanco mediante la inhibición directa y reversible de proteínas in vivo.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de preparación e inyección de embriones.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías del blanco.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de blancos ajustada al riesgo utilizando gradientes de gravedad fenotípica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones, microinyección e imágenes confocales en vivo.
- Depende de un equipo de microinyección, aceites antifade y sistemas de imagen de alta resolución.
- Necesita una estandarización entre equipos para la clasificación de embriones y la consistencia en las inyecciones.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la solubilidad de las proteínas, la funcionalidad de los anticuerpos y la compatibilidad de las etiquetas fluorescentes.
- Las limitaciones prácticas incluyen la viabilidad del embrión tras la inyección y las posibles barreras de difusión en embriones más grandes.
