La generación de embriones quiméricos de pez cebra mediante un trasplante

Hola, soy Hillary Kemp del laboratorio de Cecilia Owens. Y yo soy Cecilia Owens. Hillary y yo pertenecemos a la división de ciencias básicas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle.

Hoy les mostraremos una técnica para elaborar embriones de pez cebra quiméricos, también conocidos como mosaicos genéticos. Este procedimiento nos permite evaluar la base celular de la función génica durante el desarrollo. Podemos determinar si un gen determinado funciona dentro de las células con fenotipo mutante, conocido como función autónoma celular, o dentro del entorno de esas células, conocido como no autonomía celular.

Realizamos estos mosaicos trasplantando células entre embriones de tipo salvaje y mutantes en una etapa de blástula o de gastrulación temprana. Posteriormente evaluamos la función génica observando el fenotipo y el genotipo de las células derivadas del donante en su entorno huésped. Así que comencemos.

En esta parte del protocolo, se inyecta un colorante de linaje en el embrión donante para poder seguir las células derivadas del donante tras el trasplante. También se puede inyectar cualquier tipo de ácidos nucleicos mediante esta técnica; sin embargo, omita el paso de decoración cuando inyecte ADN. Antes de trabajar con los embriones, prepare un platillo de inyección insertando un portaobjetos de vidrio en un ángulo de 45 grados a través de la parte más ancha de una placa de Petri. Tres cuartas partes llenas con medio embrionario de aros al 1,2 % en penicilina-estreptomicina.

Retire la placa después de que el agro se solidifique para formar una ranura biselada. Llene la ranura con medio embrionario de penicilina-estreptomicina. A continuación, continúe con la desecación enzimática de embriones en el estadio de una célula.

Incube los embriones en la etapa de una sola célula durante uno a cinco minutos en una solución de pronasa de 0,5 miligramos por mililitro. Observe atentamente la desvitalización.

En cuanto el corion comience a colapsarse visiblemente, sumerja los embriones en agua del sistema y vierta todo el corion, dejando que los embriones permanezcan en la parte inferior de la curvatura del pico. Es muy importante que los embriones no toquen la superficie del agua ni una sola vez más, ya que la mayoría ya ha perdido su corion. Quedan algunos girando en el exterior que no lo han perdido.

Si algo aún está dentro de su corion, entonces el acto de pipetearlos de esta manera los liberará y soltará los embriones para que nunca toquen la superficie del agua. Es importante manipular los embriones recubiertos con una pipeta que haya sido pulida al fuego para suavizar sus bordes. Transfiera suavemente los embriones dec recubiertos, que son frágiles, hacia la depresión del platillo de inyección utilizando una pipeta de vidrio de gran orificio pulida al fuego.

Luego cargamos un solo archivo en esta cubeta. Ahora los embriones están listos para ser inyectados con un marcador de linaje utilizando una micropipeta de vidrio estirada con fuego, calibrada con precisión, y un sistema de inyección por presión. Vamos a usar un recipiente lleno de medio para embriones para romper la punta de la aguja y un recipiente lleno de aceite para calibrar la aguja.

Este es simplemente un aceite mineral de grado de laboratorio estándar. Tomamos un par de pinzas de relojero afiladas y, luego, mirando a través de los oculares para determinar cuál sería el tamaño adecuado, colocamos las pinzas en ambos lados de la aguja y, a continuación, rompemos suavemente la punta, lo cual en realidad no puedo hacer sin mirar, para determinar el volumen de colorante o ribonucleótido que se está administrando. Antes de comenzar.

Mida el tamaño del bolo en un recipiente con aceite mineral. La aguja debe romperse de manera que se administre un bolo de un nanolitro con uno o dos pulsos del microinyector. El volumen del bolo puede calcularse a partir de su diámetro, medido mediante un micrómetro de ocular.

Injecte un nanolitro de una solución al 1-3% de dextrano fluorescente directamente en el vitelo de embriones recubiertos entre las etapas de una y cuatro células. Lo que voy a hacer es posicionar el embrión justo debajo de la aguja. Voy a insertar suavemente la aguja en el centro del vitelo y presionar el pedal con el pie.

Una vez que se inyecta, es importante inyectar en las corrientes del vitelo para que el colorante sea transportado hacia las células. Esta inyección será suficiente para rastrear las células en embriones quiméricos durante varios días de desarrollo. Idealmente, realizamos esto antes de que las células alcancen la etapa de cuatro células. Incubar los embriones inyectados a baja densidad en una placa de Petri recubierta, llena con medio de embrión fresco con penicilina y estreptomicina.

Tenga en cuenta que los embriones inyectados tienden a tener una tasa de desarrollo ligeramente más lenta; incube los embriones a diferentes temperaturas: 25, 28 y 31 grados Celsius, para desincronizar su desarrollo y maximizar la ventana de tiempo durante la cual se pueden realizar los trasplantes. El aparato utilizado para el trasplante celular en la blástula de pez cebra consiste en una jeringa Hamilton controlada por un mecanismo de avance, conectada mediante una llave de paso de tres vías a un depósito de aceite mineral y a un porta-pipetas micrométricas a través de un tramo de tubo flexible. Elimine todas las burbujas de aire del sistema, ya que afectarán negativamente su capacidad para controlar la succión y la presión.

Utilice un microscopio estereoscópico que tenga óptica de alta calidad con al menos un aumento DX. Para controlar la posición del porta-pipetas micrométrico y la aguja, sugerimos un micromanipulador manual NARA shige. Asegúrese de fijarlo al banco mediante una base magnética para evitar que las vibraciones se transmitan al trasplante.

Las agujas para trasplantes se fabrican a partir de pipetas capilares de vidrio que se estiran hasta formar una punta suave en un polarizador de electrodos. Consulte el protocolo de JoVE del laboratorio de Miriam Goodman para obtener detalles sobre cómo estirar las pipetas bajo un microscopio estereoscópico y romper la punta de la aguja estirada. Para trasplantes en estadio de blástula, el diámetro externo de la aguja debe medir aproximadamente entre 50 y 60 micrones, o entre 30 y 40 micrones para una transferencia en estadio de gástrula.

Para una transferencia al estadio gástrico que mejore la penetración, es necesario crear una punta afilada en el extremo de la aguja utilizando primero una microherramienta de forja; alise la punta de la aguja acercándola al filamento de la microherramienta de forja. Luego gire la aguja de modo que el borde del bisel entre en contacto con el filamento. Una vez que el borde anterior de la aguja toque el filamento, retírela rápidamente para formar una barba.

Para evitar dañar las células, la barba debe ser recta y la punta de la aguja no debe estar curvada. Con el equipo y las agujas de trasplante preparados, ya está listo para crear embriones quiméricos. Los trasplantes en blástula se utilizan para trasplantar células entre embriones cuando no se requiere información detallada del mapa de destino celular. Con la excepción de las células germinales primordiales, la mayoría de las células generalmente no están comprometidas con un destino específico en esta etapa.

El mapa de destino de la blástula es tal que podemos distinguir entre células que van a dar lugar al ectodermo y células que van a dar lugar al mesodermo. Las células mesodérmicas y endodérmicas se encuentran cerca del margen del embrión en estadio de blástula, mientras que los precursores dérmicos, que darán lugar al sistema nervioso y a la dermis superficial, se sitúan más alejados del margen del embrión. Por lo tanto, cuando trasplantamos células a embriones en estadio de blástula, podemos dirigirlas hacia el mesodermo presumible o hacia el ectodermo presumible.

Pero no podemos dirigir las células a ninguna región particular del ectodermo o del mesodermo porque no lo sabemos. En la etapa de blástula, en la que se encuentra el lado dorsal del embrión, prepare platos para inyección con antelación flotando un molde de plástico con hileras dobles de protrusiones en forma de cuña en un plato de Petri, lleno hasta la mitad con agarosa al 1,2 % fundida en medio embrionario. Una vez que la agarosa se haya solidificado, retire la plantilla dejando hileras de pozos en forma triangular, cada uno lo suficientemente grande para contener un embrión.

Llene el molde de trasplante con medio para embriones penicilina-estreptomicina y cargue individualmente embriones en estadio de blástula en cada pocillo utilizando una pipeta de vidrio pulida al fuego. A continuación, transfiera los embriones a los pocillos de trasplante y déjelos inicialmente reposar de lado. Organice los embriones de manera que los embriones donantes se coloquen en una columna y los embriones huésped se coloquen en la columna adyacente.

Coloque el plato sobre la platina de manera que, cuando la aguja de trasplante penetre en un embrión, la aguja empuje al embrión contra la pared posterior de su pocillo. Utilizando el micromanipulador, baje la aguja de trasplante hacia el plato con un ángulo bastante pronunciado. Idealmente, la aguja de trasplante debe penetrar en el embrión aproximadamente con un ángulo de 45 grados.

Una vez que la punta de la aguja esté por debajo de la superficie del medio embrionario, aspire una pequeña cantidad de medio embrionario hacia la aguja girando el micrómetro que controla la jeringa Hamilton. Para obtener el mayor control preciso, la interfase entre el aceite mineral y el medio embrionario debe permanecer en la parte estrecha y cónica de la aguja, no demasiado cerca del extremo. Posicione suavemente el embrión donante con la aguja, luego retire la aguja y entréguela en el casquete de blástula del embrión en la posición deseada.

Un golpe fuerte y rápido penetrará el embrión sin hacer que gire. Aspire lentamente y con cuidado las células donantes hacia la aguja para evitar dañar las células por cizallamiento. Evite aspirar yema dentro de la aguja una vez que se haya tomado el número deseado de células.

Invierta ligeramente la presión para detener la succión y retire la aguja para colocar el embrión huésped en posición. Al mover el recipiente de trasplante, se pueden realizar pequeños ajustes en la posición del embrión huésped girándolo suavemente con la aguja de trasplante, siempre que se tenga cuidado de no tocar la yema. Al expulsar las células donantes al embrión huésped, evite introducir yema en el embrión, ya que esto dañará y matará las células donantes. Las células de un solo embrión donante pueden trasplantarse a múltiples huéspedes después de completar las transferencias celulares.

Transfiera los pares de huéspedes donantes a los pozos recubiertos de una placa de 24 pozos para continuar el desarrollo. La única excepción a la regla de que las células no están comprometidas con destinos particulares en la etapa de blástula son las células germinales primordiales. Las células germinales primordiales se especifican muy temprano en el desarrollo y están comprometidas con su destino de estado de célula germinal primordial.

Desde una etapa muy temprana, las células germinales primordiales se encuentran cerca del margen de un embrión en estado de blástula y de gástrula. Por lo tanto, si el objetivo del experimento de trasplante es trasplantar células germinales primordiales, entonces es muy importante de dónde provienen las células en el embrión donante y no es importante a dónde van en el embrión huésped. Así, la regla es que para las células somáticas, es importante a dónde van en el embrión huésped, ya que eso determinará su destino.

En el caso de las células germinales primordiales, es importante de dónde provienen en el embrión donante porque su destino ya está determinado. Si el objetivo es trasplantar células germinales primordiales, entonces estas células deben recogerse del margen del polo del embrión donante, y se sitúan justo cerca del margen del embrión en cuatro pequeños grupos, cada uno compuesto por tres o cuatro células, en esta fase, conocida como fase de lámina o fase alta de desarrollo. Y es necesario recogerlas con mucha delicadeza para no comenzar accidentalmente a aspirar la yema.

Vale, y eso es lo que he hecho allí, y ahora estoy pasando a un embrión huésped. Ahora, las células germinales primordiales migrarán hacia la región de la cresta genital del embrión en el que se encuentren. Por lo tanto, no es necesario trasplantar estas células germinales primordiales al margen, ya que ellas mismas llegarán hasta allí.

Así que simplemente estoy trasplantando y colocando las células nuevamente en cualquier lugar del embrión posinicial. La clave en los trasplantes de células germinales, que es justo lo opuesto a cualquier otro tipo de trasplante, es el origen de las células donantes. Trasplantar células en un hospedador en etapa de gastrulación permite al experimentador aprovechar el mapa de destino del pez cebra que surge cuando se hace visible el escudo embrionario.

Se vuelve posible distinguir diferentes tipos de tejidos, así como los dominios dentro del sistema nervioso central presumido. Al transferir células entre embriones en la etapa de gástrula, existen algunas variaciones en el protocolo, pero el procedimiento general es similar al trabajo con blastocistos para montar gástrulas. Primero, extienda una franja vertical de metilcelulosa en la depresión de un portaobjetos de vidrio con hendidura, luego inunde con una cantidad generosa de medio para embriones con penicilina-estreptomicina utilizando una pipeta de fuego pulido para la transferencia.

Un donante y tres huéspedes en estadio de escudo para el portaobjetos de depresión. Seleccione embriones donantes que sean ligeramente más jóvenes que los huéspedes. Se requiere una herramienta nueva para manipular el pegamento gastros; inserte los extremos de un trozo corto de hilo de pesca de dos libras en el extremo de un tubo capilar.

Así se forma un pequeño lazo. Utilice el lazo para enrollar suavemente los embriones donantes y huéspedes hacia la parte superior de la tira de metilcelulosa e introdúzcalos dentro de la metilcelulosa hasta que queden sujetos. Colóquelos en posición de modo que la región objetivo quede en la parte superior.

Dado que durante el trasplante la aguja penetrará tangencialmente en el embrión para administrar las células donantes sin dañar el vitelo, los trasplantes en la etapa de gastro se realizan mejor en un microscopio compuesto con etapa fija. Utilice los controles del micromanipulador para enfocar la punta de la aguja de trasplante.

Coloque el soporte de la micropipeta y la aguja con un ángulo bastante abierto, de modo que la aguja esté lo más cerca posible de la horizontal, según lo permita el borde de la depresión en el portaobjetos. A continuación, atraviese el embrión donante. Si está montado correctamente, no girará cuando la aguja de trasplante entre, a menos que el embrión sea demasiado viejo y no permita que la aguja penetre fácilmente.

Para evitar perforar el vitelo, la aguja debe penetrar el embrión en un plano focal que esté ligeramente más profundo que el del EDL. Una vez perforado, se puede extraer un gran número de células del donante para realizar hasta tres inyecciones en células huésped. Al aspirar las células, evite succionar el vitelo moviendo la aguja mientras se toman las células, si así se desea.

Pueden recolectarse embriones adicionales para obtener más células utilizando la misma aguja antes de expulsar las células al huésped; durante la expulsión de las células al embrión huésped, libere las células mientras se retira la aguja a través del área objetivo, en lugar de depositar las células en un solo cúmulo. Esto aumentará la probabilidad de que las células donantes contribuyan al tejido deseado. Una vez completadas las transferencias celulares, coloque toda la laminilla en una placa de Petri y cúbrala cuidadosamente con medio para embriones con penicilina-estreptomicina.

En las próximas horas, la metilcelulosa se disolverá, liberando los embriones. La cantidad de células transferidas depende del objetivo específico del experimento. Las células de un solo donante pueden trasplantarse en tres o cuatro huéspedes a la mañana siguiente al trasplante.

Los huéspedes pueden examinarse para determinar si el direccionamiento de las células donantes fue exitoso. El trasplante exitoso de células germinales primordiales de la etapa de blástula da como resultado células marcadas con fluorescencia, posicionadas ventralmente cerca de la unión entre el ylk y la extensión del ylk. Así, acabamos de mostrarle cómo realizar trasplantes en las etapas de gástrula y blástula.

Al realizar esta técnica, es importante elegir el tipo adecuado de método de trasplante para el tejido diana al que se desea dirigir las células. Por lo tanto, el trasplante en estadio de blástula es suficiente para determinar si las células van a la dermis o al ectodermo. Además, esta técnica también puede utilizarse para dirigirse a las células germinales primordiales.

Si desea realizar un mapeo más detallado, es mejor utilizar un trasplante de edad gastrular en el que ya se haya determinado el lado dorsal. Con esta técnica, puede dirigir células a diversas partes del sistema nervioso, en particular, al prosencéfalo, mesencéfalo, rombencéfalo y médula espinal. Eso es todo.

Muchas gracias por ver este video y mucha suerte con todos sus experimentos.