Un método de alto rendimiento para la crioconservación de esperma de pez cebra y In Vitro Fertilización
6 de julio de 2009
Este es un protocolo de esperma de alto rendimiento para la criopreservación de pez cebra. Espermatozoides criopreservados utilizando este protocolo tiene un promedio de 25% de la fertilidad en la fertilización in vitro posterior y es estable durante muchos años.
Hola, soy Bruce Draper de la Universidad de California Davis, del departamento de Biología Molecular y Celular, y soy Cecilia Moans de la División de Ciencias Básicas del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson en Seattle. Hoy, Cecilia y yo vamos a demostrar el protocolo de criopreservación de esperma de pez cebra, que es una modificación del protocolo original de Brian Harvey. Les mostraremos que, trabajando en equipos de dos personas, es posible criopreservar esperma de 100 machos individuales en menos de dos horas.
Aunque existe un amplio rango de fertilidad tras el descongelamiento, en promedio obtenemos una fertilidad del 25 %, y esto proviene de una biblioteca que ha sido criopreservada durante más de siete años. Así que comencemos. Antes de realizar este procedimiento, primero prepare las soluciones para congelación de espermatozoides.
La solución de Ginsburg Fish ringer se prepara fresca cada tres días, y el medio de congelación se prepara fresco diariamente, con y sin metanol. La composición de estas soluciones puede encontrarse en la información suplementaria en línea que acompaña a este protocolo. Los materiales utilizados en este procedimiento pueden afectar la velocidad de congelación y descongelación, lo que a su vez puede afectar la fertilidad del esperma congelado.
Por este motivo, también se proporciona una lista de materiales recomendados como información complementaria en línea. Es preferible congelar el esperma sobre hielo seco finamente triturado en lugar de usar pastillas de hielo seco. Una forma sencilla de triturar el hielo seco es envolverlo en una toalla y pulverizarlo con un martillo.
Un método más eficiente consiste en utilizar un molino de hielo seco, como el modelo RE con garras, para congelar el esperma de pez cebra. Primero marque tubos capilares de 10 microlitros con un rotulador de laboratorio a la altura de 3,33 microlitros o aproximadamente 16,7 milímetros desde el fondo. Para anestesiar a los machos, coloque de dos a cuatro machos en un vaso de precipitados que contenga trica diluida y agua para peces. La receta se puede encontrar en el libro del pez cebra.
Una vez anestesiado, levante el pez fuera del anestésico utilizando una cuchara de plástico y séquelo suavemente con una toalla de papel. Preste especial atención a secar el lado ventral. El agua activa los espermatozoides, por lo que es fundamental secar completamente alrededor del ika.
Coloque el pez sobre el soporte de esponja con el lado ventral hacia arriba. Si la zona alrededor de las aletas pelvianas aún está húmeda, séquela suavemente con una toallita Kim. Coloque el tubo capilar marcado en un adaptador de pipeta de goma que se incluye con los tubos capilares.
El adaptador es una manguera de goma que tiene una boquilla en un extremo y un porta capilares en el otro. Alternativamente, el tubo capilar puede conectarse a una jeringa Hamilton de 50 microlitros. Utilizando un trozo corto de tubo de tigón del diámetro adecuado, coloque el macho bajo el microscopio y exponga la abertura urogenital separando cuidadosamente las aletas pélvicas.
Utilizando el extremo del tubo capilar, exprese el esperma acariciando suavemente los costados del pez con pinzas lisas o apretando suavemente los costados del pez con el dedo índice y el pulgar; recoja el esperma en un tubo capilar a medida que se expulsa, aplicando succión suave. Evite las heces que podrían expulsarse junto con el esperma. El volumen objetivo de esperma es de 3.3 microlitros.
La cantidad mínima de espermatozoides aceptable varía según la calidad del esperma. Un buen esperma es blanco y opaco, mientras que el esperma deficiente tiene aspecto acuoso. En general, la cantidad mínima aceptable de espermatozoides es un microlitro de esperma de buena calidad o un tercio del objetivo, y dos microlitros de esperma deficiente o dos tercios del objetivo.
Si el volumen de espermatozoides no alcanza el volumen objetivo de 3,3 microlitros, es necesario normalizar el volumen hasta la marca del rotulador utilizando medio de congelación sin metanol. Si el volumen de espermatozoides ya alcanza o supera la marca del rotulador en el tubo capilar, continúe con el siguiente paso. Ahora agregue el crioprotector al esperma.
Absorber medio congelante con metanol hasta la marca naranja. El volumen total aproximado ahora es de 20 microlitros. Expulsar la mezcla de espermatozoides y crioprotector sobre un área limpia de un vidrio de reloj, mezclando suavemente mediante pipeteo ascendente y descendente aproximadamente cuatro veces y evitando introducir burbujas.
Aliquotar el esperma en dos viales criogénicos pipeteando 10 microlitros de la solución crioprotectora de espermatozoides en el fondo de cada vial etiquetado. Tapar rápidamente los viales y colocar cada vial criogénico en un tubo Falcon separado de 15 mililitros. A temperatura ambiente, tapar los tubos Falcon e introducirlos en hielo seco finamente pulverizado.
Los tubos deben insertarse lo suficientemente hondo como para que solo se vean las tapas, a fin de llevar un control de los tubos falcon. Numérelos y registre la hora a la que cada tubo se coloca en el hielo seco. Deje que el esperma se congele en el hielo seco durante 20 minutos.
Después de congelar el esperma, transfiera los dos viales criogénicos a un frasco Dewar que contenga nitrógeno líquido para almacenamiento temporal. Coloque la caja congeladora en un baño de nitrógeno líquido para que las muestras no se calienten.
Utilice pinzas metálicas largas para recuperar los viales del matraz y manipúlelos con guantes criogénicos. Alternativamente, los viales criogénicos pueden transferirse directamente del hielo seco al congelador. Si la caja del congelador se mantiene sumergida en nitrógeno líquido dentro de un recipiente de poliestireno para almacenamiento a largo plazo, coloque los viales criogénicos en un congelador criogénico de nitrógeno líquido.
Para mantener la viabilidad de los espermatozoides, es fundamental que los viales se almacenen sumergidos en nitrógeno líquido; los viales almacenados en la fase de vapor pueden perder viabilidad con el tiempo. La rapidez también es fundamental para mantener la viabilidad espermática. El tiempo entre la adición del crioprotector y la colocación de los viales de espermatozoides en hielo seco no debe superar los 30 segundos. Fecundación in vitro.
El uso de espermatozoides criopreservados funciona mejor con dos personas. Una persona exprime los óvulos de las hembras mientras la otra descongela el esperma. Ajuste un baño de agua a 33 grados Celsius.
Retire un vial criogénico del congelador de nitrógeno líquido y transfiéralo a un recipiente D o matraz que contenga nitrógeno líquido hasta que esté listo para descongelarse. Exprese los huevos de hembras anestesiadas dentro de una placa de Petri plástica de 35 milímetros. Esto se describe en detalle en el protocolo de JoVE titulado Producción de pez cebra gino-genético mediante presión temprana, que proporciona una descripción detallada del pez cebra.
En la fertilización in vitro, una buena postura contiene más de 150 huevos que son uniformes y de color amarillento. Cualquier residuo blanco indica degradación. Si es posible, intente obtener tres posturas de huevos y combínelas en un solo recipiente.
Si no se obtienen tres buenos grupos en el transcurso de un minuto a partir del primer grupo, continúe con el siguiente paso. Mantenga el recipiente cubierto mientras se descongela el esperma. Mientras tanto, retire el vial del nitrógeno líquido y quite la tapa.
Sumerja rápidamente el vial hasta la mitad en un baño de agua a 33 grados durante ocho a 10 segundos. Añada rápidamente 70 microlitros de solución salina tamponada de Hank a temperatura ambiente al vial y mezcle pipeteando arriba y abajo; inmediatamente añada la mezcla a los huevos en la placa de Petri y mezcle suavemente con la punta de la pipeta. Luego active inmediatamente los espermatozoides y los huevos añadiendo 750 microlitros de agua para peces, agite para mezclar e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Después de cinco minutos, llene el recipiente con peces, agua e incube a 28 grados Celsius. Después de dos a tres horas, cuente y transfiera los embriones viables a placas de 100 milímetros, con 50 embriones por placa. También cuente los huevos fertilizados para poder determinar la fertilidad de la muestra de esperma.
La fertilidad del espermatozoide es la proporción entre embriones viables y el número total de óvulos utilizados para la fertilización in vitro. Los óvulos pueden clasificarse en cualquier momento entre dos y seis horas después de la fertilización in vitro. Cuando los óvulos infértiles se distinguen fácilmente de los embriones viables, los óvulos infértiles son claros y no divididos.
Cuando se observa con iluminación transmitida en un microscopio estereoscópico, la fertilidad promedio del esperma criopreservado varía ampliamente. Sin embargo, debería ser posible obtener un promedio de fertilidad del 25 % que se mantenga estable durante varios años. Este gráfico muestra el porcentaje promedio de fertilidad del esperma congelado entre 2001 y 2003 y analizado tan recientemente como en 2008.
Acabamos de demostrar un método de alto rendimiento para la criopreservación de esperma de pez cero. Al realizar este protocolo, es importante utilizar todo el equipo y utensilios plásticos recomendados, así como hielo seco triturado pulverizado en lugar de pellets de hielo seco. Es fundamental utilizar esperma y óvulos de muy alta calidad, y en el caso de los óvulos, al realizar la fertilización in vitro, tras activar el esperma, es importante utilizar el mayor número posible de óvulos para mejorar la cantidad de embriones fértiles obtenidos al final, lo que podría requerir tres o cuatro hembras, ¿verdad?
Otro componente clave del protocolo es la velocidad. Nunca debería tomar más de aproximadamente un minuto pasar de extraer el esperma del macho a colocarlo en hielo seco. Bueno, creo que eso es todo.
Buena suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este artículo presenta un protocolo de criopreservación de esperma de pez cebra de alto rendimiento, que logra una tasa promedio de fertilidad del 25 % en fertilizaciones in vitro posteriores. El protocolo es estable durante muchos años, lo que permite un almacenamiento eficaz a largo plazo del esperma de pez cebra.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología Reproductiva
- Técnicas de Criopreservación
Antecedentes
- Los peces cebra son un organismo modelo en la investigación biológica.
- La criopreservación es esencial para el almacenamiento a largo plazo del material genético.
- Mantener la viabilidad del esperma es fundamental para una fecundación exitosa.
- Los protocolos para la criopreservación del esperma pueden variar en cuanto a su eficacia.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de alto rendimiento para la criopreservación de esperma de pez cebra.
- Evaluar la fertilidad del esperma criopreservado a lo largo del tiempo.
- Proporcionar un protocolo confiable para investigadores en el campo.
Métodos Utilizados
- Preparación de soluciones para la congelación de espermatozoides y crioprotectores.
- Recolección de espermatozoides de peces cebra machos anestesiados.
- Congelación de espermatozoides utilizando hielo seco y nitrógeno líquido.
- Descongelación de espermatozoides para fecundación in vitro.
Resultados principales
- Tasa media de fertilidad del 25 % a partir de espermatozoides criopreservados.
- El protocolo permite la criopreservación del esperma de 100 machos en menos de dos horas.
- Viabilidad del espermatozoide mantenida durante un período superior a siete años.
- Técnicas específicas mejoran la tasa de éxito de la criopreservación.
Conclusiones
- El protocolo desarrollado es eficiente y efectivo para la criopreservación del esperma de pez cebra.
- Se pueden lograr altas tasas de fertilidad con técnicas adecuadas.
- Este método puede apoyar estudios genéticos a largo plazo en el pez cebra.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La criopreservación del esperma de pez cebra permite la gestión a largo plazo de recursos genéticos en descubrimientos preclínicos, apoyando la disponibilidad constante de modelos para la validación de dianas y el cribado fenotípico. El protocolo de alto rendimiento permite la criopreservación de 100 muestras masculinas en menos de dos horas, mejorando la eficiencia operativa en repositorios genéticos a gran escala. Tasas de fertilidad estables del 25 % durante varios años proporcionan resultados predecibles para ensayos de fertilización in vitro posteriores, reduciendo la variabilidad en experimentos de cruces genéticos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis genéticas mediante la conservación de líneas de espermatozoides para cruces futuros que validen la función génica en sistemas relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Los procedimientos estandarizados de recolección y congelación de espermatozoides reducen la variabilidad técnica, favoreciendo la desvinculación reproducible de objetivos entre diferentes laboratorios.
- Valor predictivo: La capacidad de almacenamiento a largo plazo permite realizar pruebas retrospectivas de modelos genéticos conforme surjan nuevos objetivos, mejorando la confianza en la continuidad traslacional.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: El esperma criopreservado proporciona una entrada biológica uniforme para ensayos de fertilización in vitro, lo que permite métricas consistentes de conversión de óvulos a embriones en la selección de compuestos.
- Valor operativo: El uso de viales criogénicos en lugar de tubos capilares mejora la manipulación de muestras y la escalabilidad del almacenamiento en flujos de trabajo de alto rendimiento.
- Preparación del ensayo: Volúmenes normalizados de esperma mediante un medio de congelación libre de metanol aumentan la uniformidad del procedimiento, favoreciendo resultados cuantitativos confiables en ensayos de fertilización.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Tasas de fertilidad estables durante siete años respaldan estudios preclínicos de varios años que requieren fondos genéticos consistentes para el perfilado del mecanismo de acción y de seguridad.
- Reducción Predictiva de Riesgos: La viabilidad confiable del esperma reduce la pérdida en la generación de modelos genéticos, mejorando las tasas de éxito en las líneas de validación de dianas guiadas por fenotipos.
- Sistema Relevante para Enfermedades: Los embriones de pez cebra derivados de esperma criopreservado permiten una evaluación fenotípica rápida en modelos vertebrados alineados con las vías de enfermedades humanas.
Integración de la tubería y del flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar un proceso ascendente escalable para la generación de embriones de pez cebra utilizados en la validación de objetivos, el desarrollo de ensayos y la selección fenotípica.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir la generación bajo demanda de embriones genéticamente definidos a partir de líneas de espermatozoides archivadas.
- Selección: El esperma criopreservado mejora la reproducibilidad y la capacidad de procesamiento en ensayos basados en fertilización in vitro para compuestos o supresores genéticos.
- Análisis: Las mediciones de la tasa de fertilidad (embriones viables por número total de huevos) proporcionan un punto final cuantitativo para evaluar la calidad del esperma y la eficiencia del cruce genético.
- Investigación Traducional: El almacenamiento prolongado del esperma garantiza la continuidad desde el descubrimiento de genes hasta la validación preclínica utilizando fondos genéticos consistentes.
- Reutilización Empresarial: El protocolo establece una capacidad de gestión de recursos genéticos reutilizables para instalaciones de pez cebra a gran escala que apoyan múltiples proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la disponibilidad del modelo genético, reducción de la ambigüedad mecanicista en estudios transgeneracionales.
- Valor operativo: La estandarización, reproducibilidad y escalabilidad del procesamiento de espermatozoides permiten la criopreservación de alta capacidad.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de continuar o descartar inversiones en modelos genéticos, eficiencia del capital al mantener colonias vivas, reducción del riesgo biológico en estudios longitudinales.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de líneas genéticas según tasas de éxito en criopreservación y estabilidad reproductiva a largo plazo.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en el manejo de pez cebra, extracción de esperma y técnicas de criopreservación.
- Los equipos necesarios incluyen molinillo de hielo seco, almacenamiento de nitrógeno líquido, tubos capilares, crioviales y baños de agua con temperatura controlada para descongelar.
- La estandarización entre equipos requiere el cumplimiento estricto de los materiales especificados (por ejemplo, hielo seco finamente triturado, tubos recomendados) para controlar las tasas de congelación y descongelación que afectan la fertilidad.
- Las consideraciones de adaptación incluyen la normalización del volumen de esperma mediante un medio de congelación sin metanol, para garantizar una preparación uniforme de las muestras frente a la variabilidad en la producción de machos.
- Limitaciones prácticas: la fertilidad varía según la muestra; el éxito del protocolo depende de la calidad del esperma y de los óvulos, y se definen umbrales mínimos aceptables de volumen de esperma.
