Visualizar el corazón latiendo en Drosophila

Se presentarán aquí dos técnicas para la visualización de un corazón latiendo en Drosophila para la disección del corazón adulto. Primero, se eliminan la cabeza y el tórax mediante un único corte a lo largo de la línea indicada. A continuación, se extraen las gónadas y se abre la cavidad corporal abdominal usando pinzas; se retira el intestino, y en el caso de una mosca hembra, también se eliminan los ovarios.

Se aspira cuidadosamente el cuerpo graso abdominal en los segmentos abdominales tres y cuatro para exponer el corazón adulto y así inmovilizar el corazón larvario. Se fija una larva individual colocada en solución tampón aplicando primero cola de histiacrilato alrededor de la región cefálica de la larva. Luego, se estira suavemente la larva y se aplica más cola en el extremo posterior y a continuación en los flancos de la pared corporal larvaria.

Hola, soy GI Fler. Hola, soy Karen er. Ambos somos miembros del programa de Desarrollo y Envejecimiento en el Instituto Burnham para la Investigación Médica.

Hoy les mostraremos los procedimientos que hemos desarrollado para visualizar el corazón latiendo de Drosophila en etapa larval y adulta. Utilizamos ambas preparaciones como una forma de visualizar, examinar y cuantificar los parámetros del latido cardíaco en la mosca de la fruta, Drosophila. Antes de comenzar, preparamos primero una solución artificial de hemolinfa.

Esta solución contiene la entrada de sacarosa, helo, que debe agregarse a la hemolinfa artificial a partir de soluciones stock refrigeradas justo antes de su uso. Para prevenir la contaminación bacteriana, lleve la hemolinfa artificial a temperatura ambiente y oxide la solución mediante burbujeo de aire durante al menos 15 minutos. A continuación, prepare varios capilares finos utilizando un tirador estándar de pipetas, que serán necesarios para la eliminación de los cuerpos grasos en la mosca.

Una vez que todo ha sido preparado, las moscas adultas deben anestesiarse. Esto puede hacerse mediante una exposición breve a fly nap durante dos a cinco minutos, pero tenga cuidado de no dejar las moscas en el fly nap más de cinco minutos. También puede utilizarse una exposición a corto plazo al frío para anestesiar a las moscas, pero no se recomienda el dióxido de carbono, ya que tiene efectos más prolongados sobre la frecuencia cardíaca y la ity.

A continuación, las moscas anestesiadas se colocan con el lado dorsal hacia abajo en una placa de Petri recubierta con una capa delgada de vaselina. La cutícula hidrofóbica de las alas y del cuerpo debe adherirse reversiblemente a la vaselina, aunque la mosca puede reposicionarse si es necesario. Se realiza un corte inicial utilizando un par de tijeras curvas de resorte.

Esto se realiza colocando las hojas de la tijera bajo las patas de la mosca y con un ángulo hacia abajo, en dirección de la superficie dorsal cerca del cuello. El cordón nervioso ventral del cerebro y las patas se eliminan con un solo corte. A continuación, la preparación se sumerge en la solución artificial de hemo-linfática oxigenada utilizando tijeras de precisión.

Se elimina el extremo posterior del abdomen, que consta de los segmentos abdominales siete y ocho, con un único corte. Esto permite el acceso para realizar cortes laterales a lo largo de ambos bordes del abdomen y sirve para seccionar la conexión entre el intestino posterior y la cutícula abdominal. Introduzca las hojas de las tijeras en la pequeña abertura del extremo del abdomen y corte la cutícula lateralmente.

Esto libera un borde del cutículo ventral. Sostenga la solapa con pinzas y realice un corte similar a lo largo del borde lateral opuesto del abdomen. Ahora se puede retirar la solapa suelta del cutículo abdominal ventral.

Los intestinos y otros órganos abdominales generalmente pueden extraerse como una sola masa utilizando fórceps de joyero y tracciones suaves. La eliminación de los órganos internos revela el tubo cardíaco latiente, que aún está unido a la cutícula dorsal por pequeños músculos arteriales y está rodeado por cuerpos grasos. Los capilares extraídos se insertan en un tubo de plástico de una dieciseisava de pulgada de diámetro conectado a una fuente de vacío.

La fuerza de succión es proporcional al diámetro de la punta, por lo que no se deben usar pipetas con puntas mayores de 40 micrones de diámetro una vez configuradas. Este sistema de succión se utiliza para aspirar el exceso de grasa alrededor del tubo cardíaco. También puede emplearse para eliminar las burbujas de aire que se acumulan alrededor de la cutícula y cualquier detrito.

Debe tenerse extrema precaución para evitar tocar el corazón mismo, y dado que la porción posterior del corazón es muy frágil, también debe evitarse esa región. Ahora está expuesto el tubo cardíaco del drosófila adulto y, si es necesario, debería estar latiendo. La cutícula y el corazón adherido pueden reposicionarse levantando suavemente la cutícula del gel de petróleo y presionándola cuidadosamente de nuevo hacia abajo.

Evitando cualquier contacto con el tejido cardíaco. En este momento, la solución que baña la preparación debe reemplazarse por hemolinfa artificial fresca. Se debe permitir que esta preparación se equilibre durante 20 a 30 minutos con oxigenación previa a cualquier manipulación.

Si la preparación debe mantenerse por más de 60 minutos, debe reperfundirse con hemolinfa artificial fresca. Esta preparación ya está lista para ser utilizada en grabaciones ópticas y también puede usarse para grabaciones electrofisiológicas o para manipulaciones histológicas. Se requiere una técnica diferente para visualizar el corazón latiendo en larvas intra.

Primero, prepare las laminillas el día anterior al procedimiento. Para ello, use un palillo para transferir aproximadamente de 50 a 70 microlitros de solución Sard sobre una laminilla de 22 por 22 milímetros. Deje que el syl guard endurezca a 65 grados celsius durante la noche.

A continuación, prepare el tampón de Brody y Bates; una vez preparado, las alícuotas pueden almacenarse a menos 20 grados Celsius y descongelarse cuando sean necesarias. Por último, prepare las herramientas necesarias para aplicar el pegamento histo acral. En primer lugar, estire varios capilares finos.

A continuación, conecte una punta de pipeta de 1,5 mililitros con un pequeño tubo de plástico de aproximadamente un treintaidosavo de pulgada de diámetro. Insertando el extremo más pequeño en el tubo, coloque un capilar con su abertura ancha en el otro extremo. Una vez configurado, cargue el capilar con pegamento histológico sumergiendo el capilar en una gota de pegamento y aplicando succión suave a través de la punta de plástico.

Al trabajar con el adhesivo, se debe tener un segundo capilar de vidrio a mano para eliminar el exceso de adhesivo de la punta del capilar de adhesivo. El adhesivo está líquido hasta que entra en contacto con solución salina tamponada, donde se endurecerá en cuestión de segundos. Sin embargo, generalmente permanece plástico el tiempo suficiente para poder retirarlo de la punta del capilar de adhesivo o durante su aplicación sobre la muestra.

Ahora, para comenzar la inmovilización de las larvas, coloque una gota de pegamento histo acral cerca de cada esquina del syl guard. Añada 50 microlitros de tampón B y B a las gotas de pegamento, que se endurecerán instantáneamente; rellene el espacio entre los puntos pegados con B y B. El pegamento mantendrá el tampón sobre el portaobjetos.

Tome tres larvas en estado de dispersión L y colóquelas sobre un trozo de papel de filtro húmedo sobre hielo durante dos minutos. Esto ralentizará su movimiento. A continuación, transfiera las larvas al tampón y oriente la larva con la cara dorsal hacia arriba.

Este es el lado de las larvas que carece de los cinturones idénticos. Aplique rápidamente un poco de pegamento entre la región cefálica y el guardacantos. El pegamento se endurecerá muy rápidamente y evitará que la cabeza de las larvas se mueva.

Con pinzas, tome cuidadosamente al animal por las espinas posteriores y estírelo suavemente. Fije las larvas en esta posición aplicando pegamento a lo largo de ambos lados de las larvas en la mitad posterior. Para reducir el movimiento adicional del cutículo por los músculos de la pared corporal, agregue más pegamento a los flancos del animal.

La larva ya está fija en esta posición. La laminilla puede colocarse en una pequeña placa de Petri llena de hemolinfa artificial o PBS y ahora pueden registrarse los latidos cardíacos sin interferencias de los movimientos de la pared corporal. El corazón de Drosophila semientero latirá rítmicamente durante horas tras la disección, siempre que se mantenga en hemolinfa artificial oxigenada fresca.

Un ejemplo representativo se muestra aquí y en la película suplementaria uno; corazones de larvas de tercer estadio en estrella, mostrados aquí, y moscas jóvenes, de una a tres semanas posteriores a la eclosión, generalmente exhiben un latido cardíaco regular a tasas entre uno y tres hercios. Las moscas mayores de tres semanas generalmente son más arrítmicas. No obstante, estos corazones aún son capaces de latir espontáneamente durante horas en hemolinfa artificial oxigenada. Los corazones y moscas adultas que resultan dañados como consecuencia del procedimiento de disección suelen presentar regiones localizadas de constricción extrema que son incapaces de relajarse y a menudo laten de forma incontrolable. Tasas de latido cardíaco más lentas que un hercio rara vez se observan en moscas menores de tres semanas de edad.

Por consiguiente, estas preparaciones se consideran dañadas y se descartan. Acabamos de demostrar cómo preparar corazones de moscas de la fruta adultos y en estado intacto parcial para imágenes ópticas. Recuerde, al realizar la preparación semientera, nunca toque directamente el corazón.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.