Concentración, la carga, y la alineación de una célula de ultracentrifugación analítica de muestras
5 de noviembre de 2009
La ultracentrifugación analítica (AUC) de células de la muestra tiene la muestra y el tampón de referencia y durante los experimentos y se expone a alto vacío y la velocidad del rotor de hasta 60.000 rpm. Este vídeo demuestra la rigurosa atención a los detalles necesarios para la concentración, la carga y la alineación de este componente muy importante de un experimento AUC.
Hola, soy Andrea Balbo. Trabajo en el grupo de Peter Schuck en los Institutos Nacionales de la Salud. En este video, les demostraremos nuestros procedimientos para el ensamblaje, carga y alineación del rotor de una celda de muestra para ultracentrífuga analítica.
Comencemos. Recopilado. A continuación se presentan los componentes de una celda de muestra para ultracentrífuga analítica. Dentro del alojamiento de la celda se apila un centro de epoxi de doble sector de 12 milímetros con campo de carbón activado, que se colocará entre dos conjuntos de ventanas. Cada conjunto de ventanas consta de una junta de ventana, un revestimiento de ventana y una ventana sujeta dentro del soporte de ventana.
Estos componentes se deslizarán luego hacia el interior del alojamiento de la celda alineando sus ranuras con la muesca que se encuentra dentro del cilindro del alojamiento, una junta del alojamiento y, a continuación, un anillo de tornillo cerrará la celda de muestra con una presión de par comprendida entre 120 y 140 libras-pulgada. Después de cargar la muestra, dos juntas de tapón del alojamiento y un tapón del alojamiento sellan los orificios de carga de la celda para evitar artefactos durante el escaneo, fugas y roturas durante los experimentos; es fundamental que todos los componentes estén limpios, secos, libres de polvo y en la mejor condición posible, que se inspeccionen frecuentemente y que se reemplacen cuando sea necesario. También necesitará lo siguiente: un ultracentrífugo analítico, un rotor de titanio de cuatro orificios, una balanza de laboratorio, una llave de par con dial legible y un soporte para llave de par, un contrapeso y pesas para contrapeso, un destornillador de cabeza plana, un par de pinzas, un pipeteador de 200 microlitros equipado con una punta de pipeta larga y cónica, herramientas de alineación y lubricante para recubrimiento por centrifugado.
Comenzamos la construcción de la célula de muestra ensamblando dos conjuntos de ventanas. Primero, coloque una junta de ventana en la parte inferior del soporte de ventana. A continuación, coloque el reborde de la ventana, también llamado almohadilla de ventana, dentro del soporte de manera que la abertura del reborde quede opuesta a la ranura del soporte y ligeramente inclinada.
Luego coloque la ventana en el soporte, alineando la marca de referencia en la ventana con la ranura del soporte para la ventana. Presione suavemente en los bordes extremos en ambos lados de la ventana. Para garantizar un sellado adecuado y una manipulación precisa de la celda de muestra, aplicamos ligeramente una capa de lubricante en la junta del alojamiento dentro del anillo de tornillo.
Con lubricante de capa delgada, extienda una cantidad muy pequeña de capa delgada entre el pulgar y el índice. Aplique una película fina e invisible de capa delgada sobre las roscas del anillo de tornillo. De la misma manera, aplique sobre la junta del alojamiento.
Elimine cualquier lubricante visible. Para comenzar el ensamblaje de la celda de muestra, deslice un conjunto de ventana con la ventana mirando hacia arriba, en dirección a usted, dentro del alojamiento de la celda alineando la ranura con la clave del alojamiento.
Alinee la ranura del elemento central con la chaveta del alojamiento y deje que caiga suavemente sobre el conjunto de la ventana en el interior del alojamiento. Nunca utilice ningún tipo de herramienta para empujar el elemento central dentro del alojamiento de la celda. Esto podría causar daños permanentes al elemento central, lo que resultaría en fugas durante los experimentos de almacenamiento.
Gire el segundo conjunto de ventana de modo que la ventana quede orientada hacia la pieza central y alejada de usted. Alinee la ranura con la chaveta del alojamiento y deslícelo hacia abajo encima de la pieza central. Coloque la junta del alojamiento encima.
Luego, un anillo de rosca de modo que la palabra "out" sea visible. Utilice los dedos. A continuación, una herramienta de alineación y apriete a mano el anillo de rosca.
A veces el componente central no se desliza fácilmente dentro del cilindro del alojamiento. Primero puede alinearlo y luego colocar el segundo conjunto de ventana encima. Aplicando una ligera presión hacia abajo sobre el conjunto de ventana.
Puede deslizar ambos en el alojamiento de la celda al mismo tiempo. De esta manera, evitamos presionar directamente sobre la pieza central. Ahora es un buen momento para revisar la celda en busca de partículas de polvo, pelusas y huellas dactilares.
También notará los anillos de Newton, que indican que aún hay aire entre la pieza central y las ventanas. Estos desaparecerán después de apretar con el anillo de tornillo hacia arriba y la palabra visible fuera. Coloque la celda de muestra completamente hacia abajo dentro de la celda.
Anillo de par del soporte de par. Sostenga la celda en su lugar aplicando presión constante sobre la manija del soporte de par. En un solo movimiento continuo, aplique par al anillo de tornillo entre 120 y 140 libras-pulgada.
Suelte la palanca del soporte de torque y retire cuidadosamente la celda de muestra. Habitualmente cargamos un volumen de 400 microlitros en cada sector del centro de 12 milímetros. Utilizando una pipeta de 200 microlitros, coloque la celda de muestra con los orificios de carga hacia arriba y la palabra out en el anillo de tornillo visible.
Deslice la punta de la pipeta hasta la mitad dentro del sector central izquierdo a través de los orificios de carga y desprenda lentamente 200 microlitros de solución de referencia. Repita una vez para completar un total de 400 microlitros, utilizando la misma punta de pipeta y la misma técnica con cuidado y lentamente. Llene el sector central derecho con 400 microlitros de solución de la muestra.
Es fundamental igualar los volúmenes de las soluciones de referencia y de muestra lo más posible. Ajustar firmemente la punta del pipeta a la pipeta, cargar y dispensar lentamente las soluciones, evitar la formación de burbujas al cargar y utilizar la misma punta de pipeta para ambas soluciones. Todo ello ayuda a mantener los volúmenes iguales para sellar la celda.
Coloque dos juntas de tapón de carcasa roja firmemente en cada orificio de carga, asegurándose de que estén posicionadas cuidadosamente entre la pieza central y la carcasa de aluminio. Cubra cada orificio de carga con un tapón de carcasa y apriete a mano con un destornillador plano pequeño. Antes de cargar el rotor, asegúrese de que el contrapeso y la celda que quedará opuesta al contrapeso tengan un peso que difiera en no más de 0,5 gramos.
Comience con una balanza en cero. Primero, pese una celda de muestra que estará colocada en la posición opuesta al contrapeso. Ajuste la tara de la balanza para restar el peso de la celda de muestra.
Luego pese el contrapeso. Aquí encontramos que el contrapeso es 4,193 gramos más ligero que la celda de muestra. Seleccione un peso de contrapeso de cuatro gramos y atorníllelo en el orificio de fijación del contrapeso, asegurándose de que no sobresalga por la parte superior.
Pese el contrapeso para asegurarse de que el peso final esté dentro de 0,5 gramos. Utilizando un rotor de cuatro orificios, coloque el contrapeso en la posición cuatro de manera que la flecha blanca sea visible y apunte en la dirección de la fuerza centrífuga. Con una herramienta de alineación, asegúrese de que esté completamente insertado dentro del rotor.
Coloque la celda de muestra de la balanza con los tapones del alojamiento orientados hacia el centro del rotor y la palabra "out" en el anillo de tornillo visible. Nuevamente, utilizando una herramienta de alineación, asegúrese de que esté completamente introducida dentro del rotor. Observe desde debajo del rotor.
Alinee el interior. Trace una marca con el punzón, marcando la marca más cercana al centro del rotor con la marca del punzón en el contrapeso utilizando una herramienta de alineación. De la misma manera, alinee la celda de muestra en la posición dos.
Una vez que todas las células están alineadas, el rotor está listo para colocarse en la cámara de la centrífuga.
Resumen
Este video demuestra el ensamblaje, la carga y la alineación de una celda de muestra para ultracentrífuga analítica (AUC), lo cual es crucial para experimentos de AUC. Se hace hincapié en el manejo y la preparación adecuados de los componentes de la celda de muestra para garantizar resultados precisos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ultracentrifugación analítica
- Métodos biofísicos
- Técnicas de preparación de muestras
Antecedentes
- La celda de muestra AUC es esencial para realizar experimentos a velocidades altas del rotor.
- Consta de múltiples componentes que deben ensamblarse con precisión.
- Mantener la limpieza y la alineación adecuada es fundamental para evitar artefactos experimentales.
- Comprender el proceso de ensamblaje es vital para los investigadores que utilizan la AUC.
Objetivo del estudio
- Proporcionar una guía detallada sobre cómo armar y cargar una celda de muestra para la ultracentrifugación analítica (AUC).
- Destacar la importancia de una preparación minuciosa en los experimentos de AUC.
- Asegurar que los investigadores puedan replicar el proceso con precisión.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje de los componentes de la ventana y del elemento central en la celda de muestra.
- Aplicación de torque para fijar los componentes de la celda de muestra.
- Carga de las soluciones de referencia y de muestra en la celda.
- Equilibrado de la celda de muestra con un contrapeso para mediciones precisas.
Resultados principales
- En el video se demuestra el ensamblaje exitoso de la celda de muestra para AUC.
- Las técnicas adecuadas de carga garantizan burbujas mínimas y volúmenes iguales.
- Los ajustes del contrapeso son cruciales para un rendimiento preciso del rotor.
- Los indicadores visuales, como los anillos de Newton, ayudan a evaluar la calidad del ensamblaje.
Conclusiones
- La atención al detalle en el ensamblaje de la celda de muestra es esencial para los experimentos de UC A.
- Seguir los procedimientos descritos puede mejorar la fiabilidad experimental.
- Se recomienda el mantenimiento y la inspección regulares de los componentes.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensamblaje y alineación adecuados de las celdas de muestra para ultracentrífuga analítica son fundamentales para generar datos biofísicos confiables sobre el tamaño, la forma, la pureza y los estados de oligomerización de las proteínas. Una preparación cuidadosa de las celdas de muestra minimiza los artefactos experimentales, garantizando la integridad de los datos para la validación de dianas y estudios mecanicistas en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. Esta rigurosidad procedimental respalda la confianza predictiva en los flujos de trabajo posteriores de cribado y optimización de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la determinación precisa de los estados de oligomerización de proteínas y de las interacciones proteína-proteína, aportando directamente información para las hipótesis de validación de dianas.
- Valor operativo: Proporciona una evaluación sin etiquetas y en solución de las propiedades macromoleculares en condiciones cercanas a las nativas.
- Valor predictivo: Reduce la ambigüedad mecanicista en la reducción de riesgos de la diana al ofrecer coeficientes de sedimentación cuantitativos y parámetros de forma.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona datos sobre el tamaño e hidrodinámica y la forma esenciales para la formulación del tampón de ensayo y la evaluación de estabilidad.
- Valor operativo: Asegura la integridad de la muestra y la monodispersidad, fundamentales para ensayos bioquímicos y celulares reproducibles.
- Integración en plataformas: Permite la caracterización biofísica de blancos purificados antes de campañas de cribado de alto rendimiento.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Permite la evaluación de la formación de complejos proteicos y de los cambios conformacionales relacionados con los mecanismos de enfermedad.
- Valor operativo: Facilita la verificación de la consistencia entre lotes de proteínas recombinantes utilizadas en modelos preclínicos.
- Continuidad traslacional: Conecta la caracterización biofísica del blanco con ensayos funcionales en sistemas relevantes para la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El flujo de trabajo de la celda de muestra del ultracentrífugo analítico se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del objetivo hasta la identificación del fármaco líder, proporcionando lecturas biofísicas que orientan las decisiones de continuar o descartar basadas en el comportamiento y la estabilidad del objetivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre la oligomerización del objetivo y las redes de interacción, permitiendo la reducción de riesgos biológicos antes del desarrollo de ensayos.
- Selección: Asegura la monodispersión y estabilidad del objetivo, afectando directamente la preparación del ensayo y la calidad de los datos en campañas de selección.
- Análisis: Genera mediciones cuantitativas del coeficiente de sedimentación y del peso molecular que permiten comparar los estados proteicos bajo diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta la biofísica del objetivo purificado con la validación funcional en modelos preclínicos mediante una calidad de material constante.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad estandarizada y reutilizable para la caracterización biofísica en múltiples objetivos y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en las propiedades del objetivo, reducción de la ambigüedad mecanicista y mayor rigor en la validación del objetivo.
- Valor operativo: Preparación estandarizada de muestras, reproducibilidad entre ensayos y escalabilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Decisiones de avance/no avance mejor fundamentadas, reducción de tasas de fracaso debido a la inestabilidad del objetivo y mayor eficiencia del capital en las fases iniciales del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Priorización de objetivos ajustada al riesgo basada en datos de desactivación de riesgos biofísicos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas biofísicas y manejo preciso de componentes ópticos.
- Depende de instrumentación de ultracentrífuga analítica, llaves de torque, herramientas de alineación y manejo de muestras compatible con salas limpias.
- Necesita estandarización entre equipos de los protocolos de limpieza, ensamblaje y aplicación de torque.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tipos de muestras, condiciones de tampón y geometrías de cámara central.
- Limitado por la fragilidad de los componentes; las ventanas y cámaras centrales son susceptibles a daños por partículas, torque inadecuado o desalineación.
