La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Hola, soy Hope Campbell, especialista en citometría de flujo del Instituto de Investigación de la Sangre en el Centro de la Sangre de Wisconsin. Hola, soy STR Baso, estudiante de posgrado en el laboratorio de la Dra. Bonnie Dieter. También estoy en el Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de la Sangre de Wisconsin.

Hoy vamos a realizar un procedimiento para aislar células mediante clasificación celular activada por fluorescencia. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar la función de las poblaciones de linfocitos y células mieloides. Comencemos.

En este procedimiento, los linfocitos B y T CD4+ se purificarán a partir de linfocitos de ratón. El número inicial de células diana debe calcularse en función del número de células necesarias y de la tasa de recuperación de la máquina utilizando este método. La tasa de recuperación típica para los linfocitos B y T CD4+ es del 85 al 90 %. La población inicial de linfocitos de médula esplénica (SP) es aproximadamente del 60 al 70 % de linfocitos B y del 20 al 30 % de linfocitos T.

Por lo tanto, si comienza con 100 veces 10 a la seis células, podrá recuperar entre 50 y 60 millones de células B y entre 20 y 30 millones de células T antes de comenzar los pasos. Las soluciones y reactivos necesarios para el protocolo deben colocarse en hielo. Estos incluyen tampón de tinción compuesto por solución salina tamponada con fosfato con 3% de suero de ternero, tampón de suspensión compuesto por 25 milimolar HEPES preparado en solución salina equilibrada de Hank o HBSS que contiene 3% de suero de ternero, una solución de Hep B 25 milimolar preparada en suero de ternero, anticuerpos de tinción y perlas de compensación.

Este protocolo también requiere los siguientes materiales y reactivos. Tubos cónicos de 15 mililitros, tubos de flujo de poliestireno o polipropileno de 12 por 75 milímetros. También se deben preparar con antelación una malla de nylon para células, azul de trien y un citómetro de hemo para la clasificación y tubos de recolección para realizar este procedimiento.

Añada 300 microlitros de la solución de FCS HEPES a tubos de flujo o un mililitro de la solución de FCS HEPES a tubos cónicos de 15 mililitros. Estos deben colocarse en hielo hasta que comience el proceso de recolección. Comience generando una suspensión de células individuales de la población celular deseada.

Si las células aisladas mediante este procedimiento se van a cultivar, todo el procedimiento de preparación celular debe realizarse en una cabina de cultivo de tejidos. Mediante técnica estéril, lave las células una vez añadiendo tampón de tinción frío con hielo y resuspenda las células invirtiendo el tubo varias veces.

Luego, centrifugue las células durante siete a ocho minutos a aproximadamente 250 ×g y 4 °C. Las condiciones de lavado pueden variar según el tipo y la concentración de células. Para citos, lave hasta 200 × 10⁶ células con 10 mililitros de tampón de tinción.

Retire cuidadosamente el sobrenadante mediante aspiración para que el botón celular permanezca intacto. Luego, re suspenda las células en tampón de tinción frío con hielo a una concentración de hasta 50 veces 10 a la sexta por 100 microlitros. Re suspenda el botón celular agitando ligeramente o vortexeando suavemente el tubo.

Luego, transfiera de 0,25 a una vez 10 de las seis células a un nuevo tubo de flujo de policarbonato o polipropileno de 12 por 75 milímetros sobre hielo. Y déjelo aparte para usarlo más adelante como muestra de control sin teñir. Al primer tubo, añada anticuerpos primarios a la suspensión celular para alcanzar la concentración final deseada. Aquí se utilizan anticuerpos anti B dos 20 conjugados con Texas rojo PE para teñir las células B, mientras que los anticuerpos anti TCR beta R conjugados con ZI y/o los anticuerpos anti CD cuatro conjugados con 700 se utilizan para teñir las células T, mezclando mediante golpecitos suaves en la base del tubo o por agitación ligera.

Vortexee y luego coloque las células en hielo e incube en la oscuridad durante 20 a 30 minutos. Tras la incubación, lave las células marcadas mediante resuspensión, suspendiéndolas en 10 mililitros de tampón frío con hielo y centrifugando como antes, tras la eliminación cuidadosa del sobrenadante. Repita este paso para lavar las células una segunda vez.

Finalmente, resuspenda las células en tampón de suspensión frío con hielo. Si los anticuerpos primarios no están directamente conjugados con un fluorocromo, agregue anticuerpos secundarios marcados o estreptavidina conjugada a la suspensión celular y, nuevamente, incube las células en hielo y a oscuras durante 20 a 30 minutos tras la incubación. Lave las células dos veces con tampón de suspensión frío con hielo.

Después de resuspender las células en tampón de suspensión frío con hielo. Determine la concentración y viabilidad celular utilizando un colorante vital como azul de tripan y un hemocitómetro. Ajuste la concentración celular a 10–20 × 10⁶ células por mililitro añadiendo tampón de suspensión, para evitar obstruir la máquina de fax con agregados de células que pudieran haber muerto durante el aislamiento.

Procedimiento y tinción. Filtre las células a través de un colador de goteo inmediatamente antes de comenzar el protocolo de clasificación. El tamaño de poro del colador debe elegirse según el tipo de célula; para citos, se utiliza un colador con un tamaño de poro de 40 micrómetros.

Recoger las células filtradas en un tubo cónico de 15 litros o en tubos de flujo de 12 por 75 milímetros, según el volumen. Colocar las células en hielo mientras se configura el citómetro para el procedimiento de ordenación. Si se utilizan perlas de compensación BD como controles positivos de un solo color, preparar un tubo control para cada color empleado en el ensayo, más un tubo control negativo sin teñir.

Después de agitar vigorosamente las suspensiones de perlas, añada una gota de cada una de las suspensiones de perlas negativa y positiva a 100 microlitros de tampón de suspensión para cada color utilizado y el control negativo. A continuación, agregue un microlitro del anticuerpo marcado a cada tubo de control positivo. En este experimento, se prepara un tubo utilizando anticuerpos PE Texas'Red B dos 20.

Uno utilizando anticuerpos fit ETCR beta y otro utilizando anticuerpos lor 700 CD cuatro, mezclados agitando suavemente la base de los tubos e incubados de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad. Lave las perlas una vez con dos mililitros de tampón de tinción y centrifugue a 200 Gs durante 10 minutos. Retire el sobrenadante por aspiración y re suspenda el sedimento de perlas en 200 a 500 microlitros de tampón de tinción.

La configuración del buffer del citómetro de flujo varía según el fabricante y debe realizarse únicamente por personal debidamente capacitado. El procedimiento de clasificación celular aquí descrito se realizará utilizando el BD defects aria. Antes de la clasificación, seleccione la boquilla adecuada según el tipo de célula que se va a clasificar.

Los tamaños disponibles para la boquilla son 70 micrómetros, 100 micrómetros y 130 micrómetros. El tamaño de la boquilla debe ser al menos tres veces mayor que el tamaño de la célula que se va a ordenar; para linfocitos, se selecciona la boquilla de 70 micrómetros. Se puede realizar un ordenamiento celular aséptico utilizando la opción de ordenamiento aséptico del instrumento.

Al utilizar esta opción, se descontamina todo el recorrido de la funda con etanol al 70 % según las instrucciones del fabricante. Asegúrese de reemplazar los filtros de la funda y sustituir el PBS por PBS estéril. Una vez que el citómetro esté listo para funcionar, coloque los tubos de recolección previamente enfriados que contienen abundante suero bovino fetal (FCS) en el dispositivo de recolección adecuado.

Los dispositivos de recolección disponibles pueden contener hasta dos tubos cónicos de 15 mililitros, cuatro tubos de 12 por 75 milímetros o cuatro tubos micro. Utilice tubos de 12 por 75 milímetros para recolectar menos de 1,5 × 10⁶ células y tubos cónicos de 15 mililitros para recolectar entre 1,5 × 10⁶ y 4,5 × 10⁶ células.

Coloque el dispositivo de recolección adecuado en la cámara de recolección de clasificación. Dirija los flujos laterales hacia el dispositivo de recolección instalado para clasificaciones multicolor. El citómetro debe calibrarse primero para compensar la superposición espectral entre los detectores.

El ejemplo mostrado aquí ilustra el solapamiento entre los espectros de emisión de Fit E y PE. Este solapamiento, indicado en el área sombreada oscura, se denomina derrame (spillover). En este caso, el derrame de PE sería detectado en el canal de Fit E y el derrame de Fit E sería detectado en el canal de PE.

Este desbordamiento debe corregirse para eliminar la fluorescencia residual de un marcador en otro canal. El proceso de corrección del desbordamiento se denomina compensación, para realizar una compensación manual. Utilice un software de citometría para configurar una plantilla que incluya un gráfico bivariado para mostrar la dispersión directa (FSC) y la dispersión lateral (SSC), y un histograma para cada fluoróforo que se utilizará.

El método para configurar estos gráficos varía según el software. Coloque el tubo de control negativo en el puerto de carga del citómetro e inicie la adquisición de datos mientras la muestra está en ejecución. Ajuste la FSC y la SSC para colocar la población de interés dentro de la escala.

Luego, ajuste la configuración del PMT de fluorescencia para colocar la población negativa o la autofluorescencia en la porción extrema izquierda del histograma. Registre el tubo de control negativo. Retire el tubo de control negativo del puerto de carga del citómetro y sustitúyalo por el primer tubo de control positivo com.

Ahora comience la adquisición. Repita este proceso para cada uno de los tubos de control positivo, registrando los datos de cada tubo. Para cada control positivo, dibuje una puerta o un cuadro de intervalo alrededor de los eventos registrados en el histograma.

Luego dibuje otra puerta de intervalo en la porción negativa del histograma. Al realizar la compensación manual, tenga en cuenta cada fluoróforo utilizado en el experimento ajustando la mediana de los positivos hasta que sea igual a la mediana de los negativos. Para ajustar la mediana, modifique los valores de solapamiento espectral, ya sea aumentándolos o disminuyéndolos, hasta que las medianas de cada parámetro fluorescente coincidan lo más estrechamente posible.

Utilizando los ajustes establecidos con las muestras de control positivo y negativo, prepárese para el procedimiento de clasificación determinando los ajustes de puerta para la muestra experimental. Coloque el tubo de células que se va a clasificar en el puerto de carga del citómetro e inicie la adquisición usando una velocidad de nueve a 10.000 eventos por segundo. Seleccione un gráfico de dispersión para mostrar la dispersión hacia adelante frente a la dispersión lateral.

La dispersión directa es un indicador general del tamaño celular y se coloca en el eje X, mientras que la dispersión lateral es un indicador de la granularidad celular y se coloca en el eje Y. Ahora delimite la población de interés. Una vez determinadas las regiones de selección, verifique que la temperatura del puerto de carga del citómetro esté ajustada a cuatro grados Celsius.

Luego, coloque el tubo de muestra experimental en el puerto de carga. Presione la opción de clasificación y comience la adquisición; los tubos de recolección deben colocarse en hielo a medida que se llenan. Continúe con la clasificación hasta que se haya recolectado el número deseado de células o hasta que el tubo de muestra esté vacío.

A continuación, detenga la clasificación volviendo a seleccionar el botón de clasificación y retire la muestra del puerto de carga. Luego, coloque el tubo de recolección directamente sobre el puerto de carga del citómetro y adquiera de 500 a 1000 eventos. Utilizando los mismos parámetros empleados para la clasificación de células T, el procedimiento de clasificación aumentó la pureza del 21 al 99 %. Para células B, la población inicial de células B del 5 % se incrementó al 98 % tras la clasificación.

Así que acabamos de mostrarle cómo purificar poblaciones de células B y T a partir de citocitos mediante fax. Recuerde, los hechos pueden utilizarse para purificar cualquier población celular si se puede generar una suspensión de células individuales y están disponibles los anticuerpos adecuados. Además, las células marcadas genéticamente con indicadores fluorescentes pueden purificarse fácilmente sin el uso de anticuerpos.

Además, recuerde siempre utilizar los controles adecuados para sus experimentos y verifique siempre la configuración del láser de citometría de flujo para asegurarse de que está utilizando los fluorocromos correctos, y asegúrese de usar compuertas apropiadas para que estas delimiten correctamente sus poblaciones. Eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.