Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ

Al combinar la hibridación in situ y la tinción con tetrámeros en una técnica conocida como ISTH, se pueden determinar las cantidades relativas y las relaciones espaciales entre las células efectoras inmunitarias específicas del antígeno viral y las células y tejidos infectados por el virus. ISTH comienza empotrándo el tejido infectado con SIV fresco en agros. El tejido se corta en secciones de 200 micrones de grosor utilizando un vibrátomo y se tiñe para detectar el antígeno viral.

Células CD8+ específicas mediante tetrámeros de MHC marcados con fitocromo C. Después de la congelación, estos cortes teñidos se seccionan adicionalmente en cortes de ocho micrómetros de grosor utilizando un criostato, y se realiza hibridación in situ para localizar las células infectadas por el virus. Se utiliza microscopía confocal para obtener imágenes de los cortes doblemente teñidos y, finalmente, reconstruir los cortes gruesos originales para revelar la relación entre las células efectoras inmunitarias y las células diana.

El uso de este procedimiento para examinar la infección temprana por SIV se ha demostrado como un buen predictor de la gravedad de la enfermedad subsiguiente. Hola, soy Chinen Lee del laboratorio de Ashley HA en el Departamento de Microbiología de la Universidad de Minnesota. Soy Pam Skinner, profesora asistente en el Departamento de Ciencias Biomédicas Veterinarias de la Universidad de Minnesota.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la hibridación in situ en el instituto, o ISTH por sus siglas en inglés. Además de utilizar la tinción con tétramer in situ combinada con hibridación in situ, como estamos demostrando hoy, también utilizamos habitualmente la tinción con tétramer in situ combinada con inmunohistoquímica para determinar la ubicación, abundancia y perfil de expresión proteica de las células T CD8 específicas para antígenos in situ. Ayudándonos hoy con la tinción in situ con tétramer en cortes gruesos estarán el Dr. Heon Kim y Terry Matala, y ayudándonos con la preparación de cortes finos y la hibridación in situ estará So. Comencemos.

Para comenzar este procedimiento, enfríe el baño Vibram que contiene PBSH estéril a entre cero y dos grados Celsius. Ajuste el ángulo de la cuchilla vibratoria a 27 grados. Siempre que sea posible, mantenga los tejidos frescos enfriados en hielo e inicie el procedimiento dentro de las 24 horas posteriores a la recolección de los tejidos.

Para minimizar la degradación por enfriamiento, el vibram también facilita el corte de un tejido fresco; retire el tejido conectivo y corte la muestra con un escalpelo en trozos pequeños, coloque los trozos en un molde para tejidos y cúbralos con agarosa al 4% de punto de fusión baja en PBS, fundida a aproximadamente 40 grados Celsius. Asegúrese de que el tejido esté en contacto con el fondo del recipiente y presione los trozos de tejido hacia abajo si flotan; solidifique en hielo durante tres a cinco minutos.

Aquí se está utilizando tejido de bazo, pero también se pueden usar con un escalpelo ganglios linfáticos, vagina, cuello uterino, útero u otros tejidos frescos. Corte los agaros alrededor del tejido y, con pinzas, transfiera cuidadosamente el tejido embebido en agaros al bloque de tejido. Continúe cubriendo un bloque de tejido Vibram con pegamento Loctite.

No mueva el trozo de tejido una vez que esté colocado sobre el bloque de tejido. Deje secar durante aproximadamente 10 minutos sobre hielo. A continuación, monte el bloque de tejido en el vibrátomo y corte el tejido en secciones de 200 micrómetros de grosor utilizando una velocidad de avance muy lenta y una amplitud relativamente alta.

Utilice un pincel para transferir las secciones cortadas a una cámara de tejido especializada colocada en el pocillo de una placa de cultivo celular de 24 pocillos, previamente llenada con un mililitro de PBSH frío. Coloque hasta cuatro secciones de tejido en cada cámara de tejido. Etiquete las muestras y asegure la tapa de la placa con una banda de goma para teñir las secciones de tejido por células T específicas del virus.

Los tetrámeros conjugados con ZI se diluyen primero en tampón bloqueante a aproximadamente 0,5 microgramos por mililitro. La solución se pipetea en una placa de 24 pocillos a un mililitro por pocillo. El tejido recién cortado se transfiere a la placa en las cámaras de tejido y se deja agitar durante la noche a cuatro grados Celsius.

Mantenga un pocillo vacío entre las cámaras de tejido que contienen muestras diferentes para evitar la contaminación cruzada de soluciones en los pasos posteriores. En este paso se pueden añadir anticuerpos dirigidos contra proteínas extracelulares o de superficie celular. Para el lavado, prepare una placa de cultivo celular de 24 pocillos que contenga PBSH frío después de la incubación primaria.

Lave dos veces transfiriendo las cámaras de tejido a una placa previamente llenada durante 20 minutos cada vez; asegúrese de drenar la mayor parte del líquido de las cámaras de tejido antes de transferirlas. Además, evite que el contenido de una muestra gotee sobre otra al mover las cámaras de tejido, y supervise las secciones dentro de las cámaras para asegurarse de que no se adhieran a las paredes. Fije las secciones con paraformaldehído fresco al 4% en PBS durante dos horas a temperatura ambiente después de la fijación.

Lavado dos veces con PBSH frío durante cinco minutos cada vez para amplificar la señal de los tetrámeros. Incubar las secciones con anticuerpos de conejo anti-fitzy en una proporción de uno a 10,000 en tampón bloqueante durante uno a tres días. En esta etapa, se pueden añadir anticuerpos contra epítopos intracelulares.

Asegurándose de permeabilizar las células y bloquear los sitios no específicos antes de la adición del anticuerpo. Es posible que también se requiera recuperación del antígeno después de la segunda incubación larga destinada a amplificar la señal. Lave las secciones en PBSH tres veces durante al menos 20 minutos y hasta varias horas cada vez.

Realice una incubación final con anticuerpos marcados con fluorocromos apropiados. Por ejemplo, se puede usar anticuerpo secundario de cabra anti-conejo SI tres para unirse a los anticuerpos de conejo anti-fitzy y hacer que las células teñidas con el tetrámero fluoreszcan en rojo. Si se utilizaron anticuerpos de ratón para contrateñir proteínas de interés, como CD8 para visualizar las células T citotóxicas, se puede usar anticuerpo secundario de cabra anti-ratón Alexa 488 para unirse a los anticuerpos de ratón y hacer que la tinción con anticuerpos haga fluorescer las células en verde. Las diluciones de cada anticuerpo deben determinarse empíricamente.

Incubar de uno a tres días, manteniendo las secciones protegidas de la luz envolviendo las placas con papel de aluminio durante esta incubación y posteriormente, ya que la luz apaga las fluorescencias. Finalmente, fijar nuevamente las secciones para asegurar los tetrámeros y los anticuerpos en su lugar. Lavar y montar sobre un portaobjetos con gelatina de glicerol que contenga cuatro miligramos por mililitro de N-propilgalato para su almacenamiento a menos 20 grados Celsius hasta preparar secciones delgadas para hibridación in situ.

Las secciones teñidas con el reactivo de tetrámero in situ pueden analizarse ahora mediante microscopía confocal para determinar la localización, abundancia y patrón de expresión proteica de las células T CD8+ específicas para el antígeno. En la imagen mostrada, secciones de tejido esplénico de un macaco infectado con el virus de inmunodeficiencia simia (SIV) fueron teñidas con tetrámeros Gag para marcar las células T CD8+ específicas para SIV, así como con anticuerpos contra CD20 y CD3. Dado que la contratinción con anticuerpos se perderá en el siguiente paso, es importante analizar los tetrámeros in situ antes de continuar.

Comience el procedimiento de corte en secciones delgadas calentando las secciones de 200 micrones de grosor a 70 grados Celsius durante cinco minutos en un bloque calefactor para desprender las secciones gruesas del portaobjetos. Una vez que las secciones estén desprendidas, incruste las mismas en OCT sobre hielo seco llenando primero la base del molde plástico con OCT. Luego coloque el tejido encima del OCT y cúbralo con OCT.

Utilice un criostato para cortar secciones de ocho micrones de grosor a partir de las secciones incluidas en OCT y adhiera las secciones de ocho micrones a portaobjetos silanizados. Luego, las muestras pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius en una caja sellada para su posterior hibridación in situ. Se utiliza una hibridación in situ estándar para detectar células infectadas por virus mediante sondas de riboprobes específicas del virus marcadas con S 35.

El procedimiento también incluye recubrir los cortes con emulsión nuclear de trazas y montar las laminillas. En un medio primario compatible con fluorescencia, se adquieren imágenes confocales utilizando un microscopio confocal BioRad MRC 1000, equipado con un dispositivo de reflexión azul en el tubo epi. La tinción con tetramero in situ se visualiza utilizando el EPI 1 605 para el fluorocromo rojo del tetramero y el EPI 2 522 DF 32 para el fluorocromo verde del CD8 en la hibridación in situ.

Utilice la reflexión azul EPI para los granos plateados resultantes de la señal de hibridación in situ en los auto-radiografías desarrolladas. Para comenzar la adquisición de imágenes, capture las imágenes de cada sección de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo, y asegúrese de obtener cada imagen con una superposición aproximada del 20 % respecto a las imágenes adyacentes. Para evitar espacios vacíos en la imagen montada reconstruida, asigne a cada imagen un nombre según su fila y columna en un archivo de Excel.

Una vez completada la recopilación de datos de las laminillas, utilice el software asistente de microscopía confocal para proyectar las imágenes Z seriadas de cada canal en una sola imagen mediante un procedimiento de acción de Photoshop versión siete disponible por parte de los autores, y luego fusione automáticamente la imagen proyecta de los tres canales en una única imagen RGB. A continuación, una las imágenes fusionadas en capas para generar una imagen de montaje de toda la sección. Asocie los granos individuales de plata y la tinción con tetramero a las células en el montaje utilizando Metamorph o Photoshop.

Asigne las coordenadas XY de los centros o OID de las células positivas para ARN viral y positivas para el tetrámero. Exporte los datos de OID a archivos de Excel como números numéricos para cada célula y utilice los datos recopilados en los archivos de Excel para determinar las proporciones de células efectoras inmunitarias o células e respecto a los objetivos virales o células T, a partir del número total de células positivas para el tetrámero y positivas para ARN viral en la sección, con el fin de capturar las relaciones espaciales entre las células positivas para el tetrámero y las positivas para ARN. Copie y pegue sus gráficos respectivos desde los archivos de Excel en un documento de Photoshop en Photoshop.

Disminuya la opacidad de una capa para alinear y escalar las cuadrículas de modo que coincidan en color, seleccione y luego copie y pegue en una nueva capa. Las posiciones de las células positivas para ARN azules descartarán la capa utilizada para alinear las cuadrículas, y las posiciones de las células positivas para el tetramérico y para el ARN viral se revelarán en la imagen aplanada. Utilizando el método ISTH mostrado aquí, podemos seguir la respuesta inmunitaria frente a la infección por SIV tras la inoculación intravaginal en esta puerta de entrada y en los tejidos linfáticos a los que se extiende la infección.

Hay grandes cantidades de células infectadas en estos sitios de tejido a los 10 días posteriores a la infección, pero incluso tres días después, hay células positivas para el marcador verde de CD A, pero aún no células positivas para el tetrámero específico de SIV teñidas de rojo. La respuesta inmunitaria es, por lo tanto, demasiado tardía para eliminar la infección.

Sin embargo, a las tres semanas después de la infección, es claramente visible una disminución en las células infectadas, especialmente en el portal de entrada. Utilizamos ISTH para mostrar que el grado de reducción se correlacionó con la proximidad espacial y los números relativos de células efectoras inmunitarias positivas para el tetrámero. Células diana positivas para N-S-I-V-R-N-A, a esto lo llamamos la relación E a T in vivo.

Las relaciones espaciales se visualizan fácilmente mediante este método, con las células efectoras en rojo y los blancos virales en azul en este ganglio linfático infectado. Muchas células efectoras y diana están en estrecha proximidad, y existen zonas donde varias células efectoras rodean una única célula positiva para S-I-V-R-N-A, mientras que en otras áreas una célula positiva para S-I-V-R-N-A permanece aislada. La proporción de ETT se calcula simplemente determinando las posiciones de las células y registrando el número de cada tipo en el archivo de Excel.

El mejor control de la infección viral se correlaciona con un exceso considerable de efectores rojos sobre objetivos verdes de 43 a uno. En este caso, en el cuello uterino y la vagina, donde comenzó la infección, las proporciones ETT fueron más bajas en los ganglios linfáticos. La correlación positiva entre proporciones ETT elevadas y la reducción de la carga viral desde su pico indica que una respuesta inmunitaria más robusta en la puerta de entrada se traduce en un mejor control de la infección.

Acabamos de mostrarle cómo detectar simultáneamente las células CDAT muy específicas y las células infectadas por el virus in situ. Esta técnica nos permite visualizar simultáneamente las células T específicas para el antígeno y las células infectadas por el virus en los tejidos. Esta técnica puede aplicarse para evaluar la vacuna basada en linfocitos T positivos para CD8 y otras interacciones entre patógenos no valorados y el huésped al realizar este procedimiento.

Es importante mantener todos los reactivos libres de RNAs antes de la hibridación. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.