Ensayo del anillo aórtico
24 de noviembre de 2009
La angiogénesis, el surgimiento de los vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, se asocia con procesos naturales y patológicos. Aquí se demuestra un ensayo de anillo aórtico que permite a los potenciadores e inhibidores de la angiogénesis que se añade directamente a los anillos de la aorta en la cultura. Surgimiento y extensión de neovasos se puede determinar mediante la inspección de los anillos de aorta en un período de 6-12 días.
El objetivo general del ensayo de anillos aórticos consiste en proporcionar un sistema experimental flexible en el que se formen brotes de vasos sanguíneos a partir de fragmentos completos de aorta de ratón dentro de una matriz tridimensional. Esto se logra primero mediante la disección de la aorta torácica de un ratón y luego limpiándola cuidadosamente de cualquier tejido circundante residual. Se colocan secciones de la aorta limpia, o anillos aórticos, en pozos individuales de una placa de 48 pozos, cada uno conteniendo extracto de matriz basal o BME moldeado en forma de cúpulas.
Una gota adicional de BME encierra el anillo en una estructura tridimensional. La matriz puede contener cualquier reactivo experimental elegido. Tras una incubación de varios días, se puede observar la formación de vasos a partir de los anillos aórticos y evaluar el potencial angiogénico de los compuestos en prueba.
Hola, soy Karen Bein del laboratorio del Dr. E Lewis en el Departamento de Bioquímica Clínica de la Universidad Beon de la Negativa en Be Sheva, Israel. Hoy les mostraremos un procedimiento para el ensayo de anillos aórticos de ratón. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los efectos de diversos materiales sobre la formación de vasos sanguíneos.
Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, permita que el extracto de matriz basal o BME se descongele sobre hielo o a cuatro grados Celsius. Una vez descongelado, continúe manteniendo frío el BME para evitar que vuelva a solidificarse.
En el día del experimento, sacrifique un ratón de seis a siete semanas de edad mediante una inyección estándar de ketamina y xilacina, sangrando rápidamente a través de las arterias del cuello, seguido de dislocación cervical. Comience el procedimiento limpiando al animal con etanol al 70 % en una cabina de flujo laminar estéril. A continuación, trabajando bajo un microscopio de disección, use pinzas estériles y tijeras de disección para realizar una incisión vertical de la piel y abrir la pared peritoneal.
La incisión debe realizarse para exponer el esternón superior, donde también se corta la caja torácica y se elimina el diafragma. Proceda a empujar cuidadosamente todos los órganos hacia un lado, exponiendo completamente la aorta torácica ubicada junto a la columna vertebral. Con la aorta expuesta, inserte pinzas estériles finas entre la aorta y la columna vertebral. Abra las pinzas y levante gradualmente la aorta de su lecho, separando el segmento torácico del resto de la aorta.
Ahora que la aorta está separada, utilice tijeras afiladas para cortarla del ratón comenzando por el extremo cercano a los vasos renales y terminando cerca del corazón. Coloque la aorta torácica extraída en una placa de Petri llena con PBS estéril frío. Una vez que se ha extraído la aorta, se pueden preparar anillos aórticos utilizando dos pinzas estériles y trabajando bajo un microscopio binocular.
Limpie la aorta torácica del tejido adiposo circundante. Asegúrese de no dañar la aorta y sosténgala solo por los bordes. La aorta debe sumergirse repetidamente en la placa de Petri que contiene PBS para prevenir la deshidratación hasta que finalmente esté limpia.
Ahora que la aorta torácica está limpia, utilice una hoja quirúrgica y trabaje bajo el binocular para cortar la aorta en anillos de un milímetro de forma uniforme. Utilizando una regla colocada debajo de la superficie de corte como guía, asegúrese de usar una hoja nueva y cámbiela de vez en cuando para mantenerla afilada. Los extremos de la aorta no se utilizan. Después de cortar cada anillo, use pinzas para transferirlo muy suavemente a un nuevo recipiente que contenga PBS frío.
Coloque todos los anillos en la misma placa con PBS para asegurar que el ensayo sea aleatorizado. Dado que cada segmento de la aorta tiene un potencial angiogénico ligeramente diferente, mantenga los anillos en hielo. A continuación, prepare la placa de ensayo utilizando puntas de pipeta previamente enfriadas.
Añada a cada pocillo de una placa de 48 pocillos aproximadamente una gota de 150 microlitros de BME frío; la gota se solidificará formando una cúpula durante el proceso. El BME permite el transporte de sustancias, la quimiotaxis celular y, lo más importante, la diferenciación y migración celular que conduce a la formación de nuevos vasos. Los pocillos periféricos se llenan con PBS para evitar la deshidratación del BME. Permita que la gota de BME se solidifique a 37 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. Una vez que el BME haya solidificado, retire cuidadosamente un anillo aórtico de la placa de Petri utilizando pinzas, con el fin de evitar daños; el anillo debe transferirse dentro de la gota de lípido que se forma entre las puntas de las pinzas. Debido a la tensión superficial del líquido, coloque un solo anillo aórtico en el centro superior de cada cúpula e incube durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Encima de cada anillo, añada adicionalmente 150 microlitros de BME e incube durante 20 a 30 minutos.
A 37 grados Celsius, el anillo ahora está encapsulado en BME y ensayo. Se pueden añadir materiales a la placa para iniciar el ensayo. Suplemente previamente el medio libre de suero para células endoteliales humanas con el material experimental o con suplemento para el crecimiento de células endoteliales como control positivo, y un control negativo.
Utilice solo medio. Añada 500 microlitros del medio suplementado con pres a cada pocillo e incube a 37 grados Celsius durante seis a 12 días. Durante este período de incubación, examine la placa bajo el microscopio y busque vasos que brotan de la aorta y vasos maduros avanzados identificados por vasos con ramificaciones adicionales.
Debe extenderse desde el tejido anular tridimensionalmente y fotografiar los anillos entre el día seis y el 12 bajo un estereoscopio de contraste de fase estándar. Además, recolecte los sobrenadantes en varios días entre el día seis y el 12, y almacénelos a cuatro grados para su uso dentro de un día o en Eloqua, y a menos 20 o menos 80 para uso futuro. Los sobrenadantes pueden analizarse mediante diversas técnicas, como Eliza para vgf o ensayo de greas para niveles de óxido nítrico.
Estas imágenes se obtuvieron 12 días después de colocar los anillos en los pocillos e incubarlos con cultivo, medio mostrado en la fila superior de las imágenes, o ECGS utilizado como control positivo para la formación de brotes vasculares observada, en el panel inferior. Cada imagen es una instantánea representativa de cuatro de los 12 anillos, cantidad que normalmente se utiliza en el ensayo por condición.
La esquina de cada anillo aórtico en cada pocillo separado es negra. Cuando se fotografía de esta manera, los anillos aórticos expuestos a ECGS muestran crecimiento vascular y las flechas señalan varios de los muchos vasos que se han formado. Cada vaso se caracteriza por cadenas de células endoteliales con ramificaciones ocasionales, lo que indica que son maduros.
No se pueden observar vasos con brotación en el cultivo. Pozos del medio en el panel superior, acaban de mostrarle cómo realizar el ensayo de aorta cuando se lleva a cabo este procedimiento. Es importante recordar trabajar con precisión y comprender sus condiciones.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Resumen
Este artículo presenta un ensayo de anillo aórtico diseñado para estudiar la angiogénesis, permitiendo el brotamiento de vasos sanguíneos a partir de la aorta de ratón en un entorno controlado. El ensayo permite la adición directa de compuestos angiogénicos para evaluar sus efectos sobre el crecimiento de nuevos vasos durante un período de días.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Angiogénesis
- Biología vascular
- Ensayos experimentales
Antecedentes
- La angiogénesis es crucial para procesos fisiológicos y patológicos.
- El ensayo de anillo aórtico proporciona un modelo para estudiar la formación de vasos sanguíneos.
- Comprender la angiogénesis puede conducir a conocimientos sobre diversas enfermedades.
- El ensayo permite probar diferentes compuestos en una matriz tridimensional.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un sistema flexible para estudiar la angiogénesis.
- Evaluar los efectos de potenciadores e inhibidores angiogénicos.
- Observar la formación de brotes vasculares a partir de anillos aórticos in vitro.
Métodos Utilizados
- Diseción de la aorta torácica de ratones.
- Preparación de anillos aórticos y su colocación en una matriz 3D.
- Incubación de los anillos aórticos con reactivos experimentales.
- Observación del crecimiento de neovasos durante 6-12 días.
Resultados principales
- Germinación exitosa de vasos sanguíneos a partir de anillos aórticos.
- Evaluación del potencial angiogénico de diversos compuestos.
- Demuestra la flexibilidad del ensayo para diferentes condiciones experimentales.
- Conocimientos sobre los mecanismos de la angiogénesis.
Conclusiones
- El ensayo del anillo aórtico es una herramienta valiosa para estudiar la angiogénesis.
- Permite la prueba directa de factores angiogénicos en un entorno controlado.
- Los hallazgos pueden contribuir a la comprensión del desarrollo vascular y de enfermedades relacionadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de anillo aórtico proporciona un modelo organotípico fisiológicamente relevante para evaluar compuestos angiogénicos y antiangiogénicos en las fases iniciales del descubrimiento. Al permitir la prueba directa de compuestos en una matriz tridimensional con crecimiento cuantificable de neovasos, este ensayo facilita la desvinculación mecanicista de dianas vasculares y la validación de vías. Este ensayo sirve de puente entre los cribados endoteliales in vitro y los modelos in vivo, mejorando la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes para programas en enfermedades cardiovasculares, oncológicas y isquémicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de los efectos del compuesto sobre la brotación a partir de tejido aórtico intacto.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas angiogénicas utilizando un sistema de explante vascular nativo.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al identificar compuestos con efectos medibles sobre la formación de vasos en un contexto relevante para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación de dosis-respuesta de moduladores angiogénicos.
- Valor operativo: Estandariza las mediciones mediante imágenes de contraste de fase y la recolección de sobrenadantes para el análisis de biomarcadores.
- Valor de escalabilidad: Permite pruebas con 6 réplicas por condición para abordar la variabilidad biológica y garantizar la robustez del ensayo.
Investigación Translacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad mediante el uso de aorta murina, reflejando respuestas angiogénicas similares a las in vivo.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir el monitoreo longitudinal del crecimiento de neovasos.
- Reducción de riesgos: Orienta las decisiones de avance al identificar compuestos con actividad proangiogénica o antiangiogénica consistente entre réplicas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, ofreciendo una lectura funcional que complementa los ensayos bioquímicos y celulares.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la vinculación del tratamiento con compuestos a cambios fenotípicos en la formación y maduración de vasos.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la inclusión estandarizada en BME y la colocación aleatorizada de anillos para minimizar el sesgo posicional.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos mediante el análisis de imágenes de la longitud y ramificación de las brotaciones, y mediante mediciones por ELISA de factores angiogénicos en los sobrenadantes.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al modelar respuestas angiogénicas en un sistema con contexto tisular.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable para la selección de diversas bibliotecas de compuestos en áreas terapéuticas que implican patologías vasculares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al observar los efectos directos sobre la formación de neovasos a partir de tejido nativo.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada de anillos, la formación de cúpulas de BME y pruebas por réplicas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar una validación fenotípica temprana de la actividad vascular.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos según su eficacia y especificidad angiogénica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en disección de roedores y manejo de tejidos bajo condiciones estériles.
- Depende de la calidad constante del BME y de la gelificación adecuada a 37 °C para la formación de cúpulas.
- Necesita protocolos de imagen estandarizados y análisis ciego para minimizar la variabilidad del observador.
- Implica la optimización de las dosis de compuestos y los tiempos de incubación según su solubilidad y estabilidad en medio acuoso.
- Está limitado por la variabilidad biológica entre segmentos aórticos, lo que requiere pruebas replicadas para obtener confianza estadística.
