Medición de los coeficientes de difusión a través de dos fotones de fluorescencia de recuperación después de photobleaching
26 de febrero de 2010
En este artículo vamos a describir el procedimiento para medir coeficientes de difusión con multi-fotón recuperación de fluorescencia después de photobleaching. Vamos a empezar por alinear el láser a lo largo del camino óptico de la muestra y la determinación de los parámetros experimentales adecuadas, y luego continuar la generación de curvas de fluorescencia y por último montaje de recuperación.
La fluorescencia multifotónica. La recuperación tras el blanqueo fotónico se demuestra fácilmente con una muestra de moléculas de colorante fluorescente que difunden libremente. Primero, se dirige un haz láser de baja intensidad hacia la muestra para generar un nivel de referencia de fluorescencia a partir de las moléculas D dentro del volumen focal del láser.
A continuación, se envía un breve destello láser de alta intensidad para fotoblanquear una porción de las moléculas de colorante dentro del volumen focal. Finalmente, el haz láser se atenúa al nivel de baja intensidad anterior y se monitorea la fluorescencia a medida que las moléculas fotoblanqueadas difunden hacia afuera y son reemplazadas por moléculas aún fluorescentes provenientes del exterior del volumen focal. La fluorescencia resultante, en función del tiempo, se analiza para obtener el coeficiente de difusión.
Hola, soy Kelly Sullivan del laboratorio de Edward Brown en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Rochester. Hoy les mostraremos cómo realizar la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo con múltiples fotones. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar la difusión en sistemas biológicos tanto in vitro como in vivo.
Así que comencemos. Para empezar, ajuste la longitud de onda del láser deseada e inserte el filtro apropiado frente al tubo fotomultiplicador o PMT. A continuación, para evitar dañar la celda pcal, ajuste la potencia del láser a 200 milivatios o menos.
Hay dos espejos orientados en forma de cuatro delante de la celda pcal. Estos espejos son necesarios y suficientes para alinear el haz láser a través de la celda pcal. Establezca el desplazamiento de voltaje en el controlador de polarización de la celda pcal en cero y ajuste la trayectoria del láser a través de la celda pcal de modo que el láser quede centrado en las ventanas frontal y posterior.
Utilice el espejo aguas arriba en la figura cuatro para centrar el haz en la ventana frontal y el espejo aguas abajo en la figura cuatro para centrar el haz en la ventana trasera. Ahora establezca el voltaje a través del cristal de la celda pcal al valor máximo. El valor adecuado depende de las longitudes de onda y se puede encontrar en el manual de instrucciones de la celda pcal.
Ajuste los espejos en la figura cuatro aguas arriba de la celda pcal hasta que la potencia de salida de la celda pcal sea máxima. Ahora cambie el voltaje a través del cristal a cero y ajuste el desplazamiento de voltaje en el controlador de polarización para minimizar la potencia de salida de la celda pcal. Restaure la potencia del láser incidente en la celda pcal al valor requerido para el experimento.
Ahora, pasando al microscopio, obtenga un buen enfoque visual sobre una muestra fluorescente estandarizada. Aquí estamos utilizando granos de polen fijos y fluorescentes. Una vez enfocado, cierre el microscopio y ajuste la potencia del láser a un nivel adecuado para la imagen de la muestra, modificando el voltaje a través del cristal de la celda pcal.
Finalmente, apague las luces y encienda el PMT. Inicie un escaneo de imagen repetido de la muestra estandarizada y ajuste los espejos aguas abajo de la celda pcal hasta obtener una imagen nítida de la muestra. Ahora veamos cómo determinar las potencias seguras de monitorización en el foco dentro de la muestra.
Para el propósito de este video, utilizaremos una muestra de tinte acuoso contenida en una depresión de una placa de vidrio y sellada con un cubreobjetos. Atenuar el láser a una potencia baja pero razonable para generar fluorescencia dentro de la muestra. Sellar el microscopio y desviar la salida del PMT al contador de fotones.
Apague las luces, active el PMT e inicie un escaneo puntual en el software del microscopio. Configure el contador de fotones para integrar en una escala de tiempo mucho más larga que el tiempo esperado de recuperación de la fluorescencia y registre un número razonable de puntos de datos. Aumente la potencia y tome otra serie de datos de conteo de fotones.
Continúe aumentando la potencia hasta que el incremento en las cuentas de fotones parezca disminuir significativamente. Con respecto al gráfico de aumento de potencia, el logaritmo de las cuentas de fotones en función del logaritmo de la potencia. Cualquier desviación de una pendiente de dos indica fotoblanqueo.
Durante la monitorización, seleccione una potencia de monitorización razonable que esté por debajo de este umbral. Ahora determinemos los parámetros de entrada para el escalador multicanal y el generador de impulsos. En el generador de impulsos.
Establezca el tiempo de pre-enseñanza para que sea una a dos veces mayor que el tiempo esperado de semirrecuperación y el tiempo de blanqueo para que sea un décimo del tiempo esperado de semirrecuperación en el escalador. Establezca el ancho del canal aproximadamente a la mitad de la duración del blanqueo y configure el número de canales por registro, de modo que el producto del ancho de canal seleccionado por el número de canales por registro sea mayor que el tiempo esperado de recuperación completa. Sumando los tiempos de preblanqueo y blanqueo, regrese al generador de pulsos y establezca la frecuencia de la secuencia de preblanqueo y blanqueo igual a un valor ligeramente menor que el inverso del producto del ancho de canal multiplicado por el número de canales por registro.
Finalmente, ajuste el número de registros por barrido en el escalador en función de la intensidad de la señal a la potencia de monitor elegida. Ahora, establezca la potencia del monitor en un nivel seguro y fije la potencia de blanqueo en aproximadamente 200 milivatios por encima del umbral de blanqueo determinado durante la prueba de blanqueo del monitor. Ambas potencias se establecen como voltajes diferentes a través del sello de cristal de la celda al, apague las luces del microscopio.
Encienda el PMT. Inicie un escaneo puntual en el software de imagen. Luego, encienda el generador de pulsos y el escalador.
Para analizar la curva de recuperación resultante, marque tres puntos importantes: la fluorescencia previa al blanqueo, la fluorescencia inmediatamente después del blanqueo y la fluorescencia al final del conjunto de datos. Utilice los valores de fluorescencia antes y justo después del blanqueo para estimar mejor el tiempo de recuperación a la mitad.
Ahora, utilice las reglas descritas en pasos anteriores para actualizar los valores de las duraciones del preblanqueo y del pulso de blanqueo. Obtenga una nueva curva y siga ajustando los parámetros hasta que la curva resultante muestre un blanqueo pronunciado y una recuperación suave. Verifique la saturación de excitación graficando el logaritmo del parámetro de profundidad de blanqueo en función del logaritmo de la potencia.
Cualquier desviación de una pendiente de dos indica saturación de excitación. Elija una potencia de blanqueo que produzca un blanqueo fuerte pero que no cause saturación. Finalmente, con los parámetros adecuados determinados, continúe registrando curvas de recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo multiphotón o curvas MP FP de su muestra de interés.
Ahora mostraremos resultados representativos de ambos datos brutos de FRAP de MP y una curva de MP F normalizada que ha sido ajustada al modelo, el coeficiente de difusión. Los datos brutos de FRAP de MP exhiben un blanqueo fuerte y una recuperación suave. Con la recuperación completa siendo reportada para la segunda mitad de los datos para ajustarlos. Primero normalizamos la recuperación al promedio de fluorescencia previa al blanqueo y luego realizamos un ajuste por mínimos cuadrados no lineales.
Con respecto al modelo adecuado, ambos conjuntos de datos se obtuvieron en fluoresceína acuosa y proporcionan coeficientes de difusión. En concordancia con la literatura, acaba de mostrarse cómo realizar un experimento de recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueamiento con múltiples fotones.
Al realizar este procedimiento, es importante tener cuidado y establecer los parámetros experimentales, en particular, la duración del blanqueo y las potencias de blanqueo y monitoreo, dentro de los límites seguros definidos en el protocolo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo describe el procedimiento para medir coeficientes de difusión utilizando la recuperación de fluorescencia por fotoblanqueo con múltiples fotones. El proceso implica alinear el láser a lo largo del trayecto óptico hacia la muestra y ajustar las curvas de recuperación de fluorescencia.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Microscopía de fluorescencia
- Medición de difusión
- Técnicas de fotoblanqueo
Antecedentes
- La recuperación de fluorescencia por fotoblanqueo multifotónico es una técnica utilizada para estudiar la difusión molecular.
- El método proporciona información sobre la dinámica de las moléculas fluorescentes en una muestra.
- Comprender los coeficientes de difusión es esencial para diversas aplicaciones biológicas.
- El procedimiento es aplicable a muestras de moléculas de colorante fluorescente que difunden libremente.
Objetivo del estudio
- Demostrar el procedimiento para medir coeficientes de difusión.
- Proporcionar una metodología detallada para investigadores en el campo.
- Mejorar la comprensión de la dinámica molecular en sistemas biológicos.
Métodos Utilizados
- Un haz láser de baja intensidad genera un nivel de fluorescencia de referencia.
- Un destello láser de alta intensidad realiza el fotoblanqueo de una porción de las moléculas del colorante.
- Se monitorea la fluorescencia a medida que las moléculas fotoblanqueadas difunden y son reemplazadas.
- Las curvas de recuperación de fluorescencia se analizan para obtener los coeficientes de difusión.
Resultados principales
- El procedimiento mide de forma eficaz los coeficientes de difusión de moléculas fluorescentes.
- Las curvas de recuperación de fluorescencia proporcionan datos cuantitativos sobre la dinámica molecular.
- El método es reproducible y puede aplicarse a diversas muestras.
- Los resultados contribuyen al entendimiento de las interacciones moleculares en contextos biológicos.
Conclusiones
- La recuperación de fluorescencia por fotoblanqueo multiphotón es una técnica valiosa para medir coeficientes de difusión.
- La metodología descrita puede ser utilizada por investigadores para estudiar la dinámica molecular.
- Aplicaciones adicionales de esta técnica pueden mejorar nuestra comprensión de los procesos biológicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición de coeficientes de difusión mediante la recuperación de fluorescencia tras fotoblanqueo con dos fotones proporciona información cuantitativa sobre la dinámica molecular en sistemas biológicos, apoyando la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Esta técnica permite evaluar de forma reproducible y sin marcadores el transporte de macromoléculas, aportando datos para el desarrollo de ensayos y mayor confianza predictiva en los flujos de trabajo de identificación de compuestos prometedores. Su aplicabilidad tanto en sistemas in vitro como in vivo mejora la continuidad traslacional y reduce la incertidumbre biológica en la toma de decisiones preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación del comportamiento de difusión de macromoléculas en sistemas relevantes para enfermedades.
- Valor operativo: Permite la reducción de riesgos biológicos mediante la medición directa de la movilidad molecular en entornos nativos o modificados.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al proporcionar métricas basadas en la difusión que se correlacionan con la interacción con el objetivo y la cinética de unión.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para cribados posteriores mediante el establecimiento de parámetros básicos de difusión.
- Reproducibilidad: Proporciona lecturas cuantitativas basadas en fluorescencia que apoyan la estandarización del ensayo entre corridas y laboratorios.
- Escalabilidad: Se integra con plataformas de automatización como LabVIEW para aumentar el rendimiento en campañas de cribado de compuestos iniciales.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Se aplica a sistemas biológicos in vivo, permitiendo la evaluación de la difusión en entornos similares a los tejidos.
- Continuidad traslacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al proporcionar lecturas biofísicas consistentes en diferentes sistemas modelo.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones de continuar o descartar al cuantificar las propiedades de transporte molecular que influyen en la distribución del fármaco y el acceso al objetivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos líder y la evaluación preclínica, proporcionando datos biofísicos que orientan el diseño y la optimización molecular.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la medición de cómo cambia la difusión de macromoléculas bajo condiciones experimentales, aclarando el comportamiento de vías y dianas.
- Tamizaje: Permite la preparación de ensayos mediante mediciones estandarizadas de recuperación de fluorescencia que garantizan una evaluación consistente de compuestos.
- Análisis: Genera coeficientes de difusión cuantitativos mediante el ajuste por mínimos cuadrados de las curvas de recuperación, posibilitando la comparación objetiva de variantes moleculares.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al permitir mediciones de difusión tanto en sistemas in vitro como in vivo, apoyando la extrapolación entre escalas.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma biofísica reutilizable para evaluar la dinámica molecular en múltiples proyectos y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en torno a la movilidad molecular y las interacciones.
- Valor operativo: Asegura la estandarización y la reproducibilidad mediante parámetros láser definidos, protocolos de blanqueo y adquisición automatizada de datos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en objetivos basándose en perfiles biofísicos derivados de la difusión.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar objetivos con características favorables de transporte molecular para el desarrollo posterior.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de dos fotones, técnicas de fotoblanqueo y cuantificación de fluorescencia.
- Depende de instrumentación que incluye láseres pulsados, celdas de Pockels, contadores de fotones y sistemas de escaneo compatibles.
- Necesita la estandarización de la potencia del láser, la duración del blanqueo y los ajustes del ancho de bin entre usuarios y sitios.
- Implica consideraciones de adaptación al pasar de modelos con colorantes acuosos a muestras biológicas complejas como células o tejidos.
- Está limitado por la necesidad de etiquetado fluorescente o fluorescencia intrínseca, lo cual puede requerir optimización para objetivos de baja abundancia.
