Fabricación y operación de una inserción de oxígeno para Adherente cultivos celulares

El dispositivo de inserción hipóxica tiene seis pilares que encajan en los pocillos de una placa de seis pocillos. El gas fluye a través de la red microfluídica en la base del pilar y puede difundirse a través de la membrana de PDMS permeable al gas, que separa la red de gas y el medio de cultivo. Este dispositivo minimiza la longitud del trayecto de difusión entre la fuente de oxígeno, la red microfluídica en la base del pilar y las células, permitiendo una equilibración más rápida de la concentración de oxígeno.

El dispositivo también permite un control mucho mayor sobre el patrón espacial de oxígeno al que se exponen las células, el cual está determinado por el diseño de la red gaseosa microfluídica elaborada mediante fotolitografía estándar utilizando máscaras fotográficas. Hola, soy Sean Ard del laboratorio del Dr. David Edington en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Illinois en Chicago. Hola, soy Ellie, también del Laboratorio Edington.

Hoy les mostraremos cómo fabricar, validar y utilizar un dispositivo personalizado para exponer cultivos celulares in vitro en una placa de seis pocillos a diferentes concentraciones de oxígeno. Hemos utilizado este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el efecto del oxígeno sobre la cicatrización de heridas, la generación de especies reactivas de oxígeno y la migración celular. Así que comencemos.

Para comenzar la fabricación del inserto oxigenante, prepare polimetil siloxano o PDMS en una proporción de 10 a 1 entre el prepolímero y el agente de curado. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, la mezcla de PDMS se añade a un molde de Dell ran previamente mecanizado, diseñado para imitar la forma de una placa de cultivo estándar de seis pocillos. Una vez curado a 75 grados Celsius durante la noche, la matriz de pilares replicada resultante formará el primero de los tres componentes que componen el inserto oxigenante, con el fin de fabricar el segundo componente clave del inserto oxigenante.

Un molde maestro de SU-8 se prepara primero centrifugando el SU-8 2150. Sobre un oblea de silicio, se aplica una máscara fotolitográfica al oblea y el SU-8 se expone a luz UV a través de la máscara fotolitográfica para crear un molde maestro con un espesor de microcanales de 300 micrómetros. Vierta PDMS sobre el molde maestro de SU-8 y cure durante dos horas a 75 grados Celsius para obtener un molde positivo que finalmente formará los microcanales en la base de cada pilar.

El tercer componente del dispositivo se fabrica centrifugando PDMS sobre un oblea de silicio a 500 RPM durante 10 segundos, seguido de 900 RPM durante 30 segundos, para obtener una membrana de 100 micrómetros de espesor. Dado que el PDMS es permeable a los gases, el oxígeno puede suministrarse directamente a los microcanales a través de esta membrana. Una vez que todos los componentes están preparados, cada superficie de unión se somete a un tratamiento con plasma de oxígeno durante un minuto.

Utilice un dispositivo de plasma portátil para unir primero los seis componentes del microcanal al arreglo de pilares; luego, perfore dos orificios en cada pilar para que sirvan como entradas y salidas de gas. Finalmente, una la membrana a la parte inferior del microcanal para facilitar la unión y expulsar cualquier burbuja. Las superficies tratadas con plasma se presionan juntas durante aproximadamente un minuto utilizando la punta plana de un par de pinzas; espere una hora entre cada unión para asegurar que el dispositivo quede completamente ensamblado y pueda calibrarse.

Una vez que se ha fabricado un dispositivo completo, es necesario calibrar el nivel de oxígeno que reciben las células al utilizar la inserción oxigenante en experimentos reales. Para la calibración, use un sensor fluorescente de oxígeno o una lámina Foxy, que contiene un recubrimiento de colorante fluorescente de rutenio que es atenuado por el oxígeno. Las láminas Foxy vienen precortadas para ajustarse al fondo de una placa de seis pocillos.

La lámina de foxy debe cortarse para cubrir la mayor parte posible de la superficie del pocillo. Dado que la lámina de foxy tiene un grosor de aproximadamente un milímetro, modifique el dispositivo para mantener la distancia deseada y lograr una difusión adecuada a través de la membrana.

Esta distancia depende del experimento, pero en la mayoría de los casos debe ser inferior a un milímetro utilizando el dispositivo de plasma portátil para cortar un portaobjetos de vidrio de un milímetro de grosor. Coloque postes de aproximadamente seis milímetros de largo y cuatro milímetros de ancho en la parte inferior del dispositivo. El dispositivo reposará sobre los postes situados encima del corte del portaobjetos.

Las laminillas de vidrio también pueden utilizarse para un intervalo de difusión de 0,17 milímetros con el fin de validar el consumo de oxígeno. Añada tres mililitros de agua desionizada a temperatura ambiente en los pocillos de la placa de seis pocillos donde se medirá el oxígeno. Coloque el dispositivo en la placa y, utilizando el software Metamorph, seleccione el número y la ubicación de las posiciones deseadas en el sensor Foxy.

Deslice para analizar las concentraciones de oxígeno. Conecte el tubo del soplete al tanque de gas oxígeno y al dispositivo inserto hipóxico. Se utiliza un regulador de flujo de precisión ajustado a un caudal de 50 a 100 mililitros por minuto para el control fino del gas suministrado.

Asegúrese de que el regulador de flujo de precisión esté cerrado. Abra primero el regulador superior del tanque, seguido del regulador de precisión. Reduzca la velocidad de flujo a entre 10 y 20 por minuto después de 15 minutos.

Para evitar la formación de burbujas en el agua, observe atentamente el valor del caudal durante la próxima hora y realice ajustes según sea necesario, ya que la caída de presión cambiará mientras el sistema se equilibra, lo que altera el caudal para capturar imágenes de la placa y los sensores foxy. Se utiliza un microscopio Olympus IX 71 equipado con fluorescencia, una cámara de dispositivo acoplado a carga de Q Imaging Tiga, SRV y el software de adquisición de imágenes Metamorpho. El microscopio está equipado con un filtro fluorescente Olympus 3 1 0 2 0, compatible con foxy, con una longitud de onda de excitación de 475 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 600 nanómetros.

Para evaluar el tiempo de equilibrio y el grado de oxigenación del dispositivo, seleccione tres puntos en la diapositiva foxy en los que medir la concentración de oxígeno. Capture una imagen de la diapositiva inmediatamente antes de iniciar el flujo de gas. Capture imágenes a intervalos de 10 segundos durante 30 minutos mientras el gas fluye a través del dispositivo para evaluar la heterogeneidad y la entrega de oxígeno.

Establezca múltiples puntos a intervalos de un milímetro que abarquen todo el ancho del canal y mida la concentración de oxígeno en la superficie del pocillo utilizando Metamorph. Exporte la intensidad media de la imagen para cada posición y represente gráficamente la concentración de oxígeno en función de la intensidad de fluorescencia. Genere una curva de calibración ajustando curvas lineales a la línea de 0 a 10 % y a la línea de 10 a 21 %, que relacionan la intensidad de fluorescencia con la concentración de oxígeno. Para cada posición medida, los datos de intensidad cruda pueden exportarse desde Metamorph y analizarse posteriormente con Microsoft Excel u otro software estadístico.

Una vez que el dispositivo haya sido calibrado, se pueden iniciar experimentos como ensayos de cicatrización; autoclave el inserto calibrado a 121 grados Celsius durante 15 minutos, dentro de las 24 horas previas al experimento, y manipúlelo en una cabina de flujo laminar para cultivos a fin de evitar contaminaciones posteriores. Sumerja el inserto de PDMS esterilizado en medio libre de suero durante 24 horas para inhibir la formación de burbujas de gas al insertarlo en los pocillos de la placa. Cultive células MDCK u otras células adherentes hasta alcanzar una confluencia del 100 % en una placa de seis pocillos y realice rasguños rectos en las monocapas utilizando la punta de un pipeta P200. Los rasguños simulan heridas en la monocapa adherente.

Aspire el medio celular sin perturbar la monocapa y enjuague con cinco mililitros de medio. Aspire nuevamente y rellene los pocillos con tres mililitros de medio libre de suero. Inserte suavemente el dispositivo en la placa, asegurándose de evitar burbujas.

Colocar el dispositivo en ángulo durante la inserción ayuda a expulsar las burbujas hacia un lado. Tenga cuidado de evitar ejercer presión excesiva sobre el dispositivo, lo que podría deformar el PDMS lo suficiente como para aplastar las células subyacentes. Coloque la placa y el dispositivo sobre un escenario microscópico calentado a 37 grados Celsius y conecte los tubos desde el tanque de gas de origen hasta los puertos de entrada y salida del dispositivo.

El incubador de cultivo debe tener un orificio para permitir la entrada de tubos, y los tubos deben conectarse. Después de colocar el dispositivo en el incubador, siga el mismo procedimiento descrito anteriormente para iniciar el flujo de gas y evaluar la cicatrización, capturando imágenes de lapso de tiempo de las células cada 20 minutos durante 15 a 18 horas, utilizando el equipo y el software de imagen descritos previamente. Se puede utilizar un algoritmo de medición de heridas para analizar el área de superficie no cicatrizada tras la duración experimental deseada. Detenga el flujo de gas, retire la placa y continúe con el procesamiento adicional de células si se desea. El dispositivo con inserto hipóxico requiere menos de dos minutos para estabilizarse a 0,5 % de oxígeno, como se muestra aquí.

El tamaño del espacio entre la membrana del dispositivo y la parte inferior del pocillo fue un factor crítico para determinar la eficiencia de equilibrio, ya que espacios más grandes requirieron más tiempo para alcanzar valores estables de concentración de oxígeno. El dispositivo también permite un gran control sobre la oxigenación espacial en un único pocillo, permitiendo la formación de múltiples condiciones e incluso generando un perfil cíclico de oxígeno a través de la superficie del pocillo. Se expusieron monocapas de células MDCK a 10 % o 21 % de oxígeno y se analizó el área superficial de la herida a lo largo del tiempo mediante el algoritmo de seguimiento de heridas por rasguño de MATLAB Ts.

Después de 11 horas de un total de 17 horas, permaneció el 6,87 % de la herida original cuando se expuso a un 10 % de oxígeno, mientras que permaneció el 64,4 % de la herida bajo un 21 %. Como se muestra aquí, las concentraciones de oxígeno presentan una correlación negativa con el área abierta de la herida para ambas concentraciones de oxígeno. Durante toda la duración del experimento, se ha mostrado cómo fabricar, validar y utilizar el dispositivo de inserción hipóxica para un ensayo de curación de heridas por rasguño. El dispositivo ofrece varias ventajas frente a otros sistemas de oxigenación, como una menor huella en el laboratorio y un control mucho mayor sobre la oxigenación espacial y temporal en la superficie celular.

El dispositivo puede ser utilizado por prácticamente cualquier laboratorio que estudie el efecto del oxígeno u otros gases, como el dióxido de carbono, sobre cultivos celulares in vitro. Al realizar este procedimiento, es importante remojar el dispositivo esterilizado y los medios de cultivo durante la noche, minimizar la formación de burbujas durante el experimento. Además, permita que el sistema se equilibre antes de comenzar el experimento.

Esto se debe a que el caudal cambia a medida que la presión en el sistema se equilibra. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.