Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

En este procedimiento, se realiza una imagen del dinamismo de la expresión génica en tejidos vegetales a lo largo del tiempo mediante el uso de robótica; primero, las semillas de frijol lima se esterilizan y colocan entre toallas de papel humedecidas en un recipiente para cultivo de tejidos, con el fin de germinarlas. Después de cuatro días, se extraen los cotiledones y se bombardean con una construcción de ADN que contiene un promotor fusionado a GFP. Los cotiledones colocados en placas de Petri se montan sobre un sistema robótico personalizado de recopilación de imágenes en dos dimensiones. El robot está programado para capturar imágenes de cada fragmento de tejido cada hora durante 100 horas.

Las imágenes se someten a un análisis de imagen, obteniendo datos cuantitativos sobre la intensidad de la expresión de GFP a lo largo del tiempo. Hola, soy John Finer, director del Laboratorio de Transformación Vegetal del Departamento de Horticultura y Ciencias de los Cultivos de la Universidad Estatal de Ohio. Soy Carlos Herandez Garcia, estudiante de doctorado en el laboratorio Finer de la Universidad Estatal de Ohio.

Hoy Carlos les mostrará el protocolo que desarrollamos para el análisis de la expresión génica y tejidos vegetales utilizando la proteína verde fluorescente. Utilizamos este procedimiento que hemos desarrollado en el laboratorio para medir la actividad de la cepa OD. Para ello, colocamos nuestro promotor primero en la región aguas arriba del gen GFP, que es nuestro gen reportero.

Mostraré cómo introducimos el control del promotor en la vena de Lima Cataly y enviamos una aplicación en nuestro sistema robótico personalizado de captura de imágenes. Finalizaré revisando nuestro protocolo para el análisis de imágenes. Comencemos este procedimiento esterilizando superficialmente semillas de frijol lima utilizando procedimientos estándar.

Coloque las semillas esterilizadas en recipientes Magenta GA7 entre capas de toallas de papel húmedas e incúbelas durante cuatro días a 25 grados Celsius. Aquí utilizamos un vector de expresión de alto número de copias, útil para análisis de promotores y elementos promotores. Este vector contiene el gen GFP, que se utiliza para visualizar la función del promotor o del elemento promotor en tejidos transformados aproximadamente una a dos horas antes del bombardeo.

Extraiga el CU de haba lima de las cubiertas de las semillas. El CU de haba lima adecuado para el bombardeo debe ser amarillo a verde claro, plano y estar libre de cualquier daño que pueda interferir con el análisis posterior de imágenes; inmediatamente después de la disección, coloque 12 CU en una placa de Petri con medio de cultivo OMS que contenga sales MS, vitaminas B5, 3% de sacarosa y 0,2% de gelrite a pH 5,7. A continuación, precipite el constructo de ADN sobre partículas de tungsteno M-10. Primero, justo antes de usarlas, re suspenda las partículas en agua estéril hasta una concentración de 100 miligramos por mililitro.

Luego, en un tubo de fuga de 0,6 mililitros, agregue 25 microlitros de partículas, 5 microlitros de ADN a una concentración de 1 microgramo por microlitro, 25 microlitros de cloruro de calcio 2,5 molar y 10 microlitros de espermina 100 milimolar. Incube la preparación de ADN en hielo durante cinco minutos, luego retire y deseche 50 microlitros de la solución que se encuentra encima de las partículas. Re suspenda las partículas recubiertas de ADN que quedan en el fondo del tubo mediante vortex.

Y inmediatamente después de vórtex, retire dos microlitros de Eloqua. Repita este paso de vórtex. Cada vez que se retire un Eloqua, las partículas recubiertas deben mantenerse en hielo y utilizarse dentro de los 15 minutos.

Ahora que el ADN está recubierto sobre las partículas, coloque dos microlitros de partículas a través de la parte superior de un filtro de jeringa en el centro de una pantalla de filtración. Luego coloque el filtro de jeringa en la unidad de soporte del filtro dentro de la cámara de la pistola de flujo de partículas o cámara PIG. Coloque un frijol lima con el extremo apical hacia arriba sobre un deflector que consiste en una malla fundida en la base de un vaso de precipitados.

Coloque la placa deflectora, que se utiliza como plataforma para sostener los tejidos durante la bombardeo en la cámara del cañón de partículas. Para bombardear el tejido, primero abra la válvula que conduce al vacío para evacuar la cámara. Cuando el vacío alcance 760 milímetros de mercurio, active el solenoide y libere el helio para propulsar las partículas.

La presión de helio utilizada para acelerar las partículas es de 50 a 60 PSI. Después del bombardeo de partículas, cierre la válvula de la línea de vacío y libere el vacío utilizando la válvula de escape. Cuando se haya liberado el vacío, abra la puerta de la cámara para recuperar el co leadin bombardeado y devuelva el co leadin al lado dal.

Hasta medio de cultivo OMS para la cuantificación y el perfilado de expresión. Bombardee un mínimo de tres co-líderes para cada construcción de ADN. También se incluye un control positivo, que proporciona un perfil de expresión génica bien estudiado.

Los cables coaxiales ya están listos para la obtención de imágenes. Encienda la lámpara de mercurio y espere 30 minutos para que la lámpara se caliente. Encienda las fuentes de alimentación para la cámara SPOT R-T-C-C-D y el controlador del motor, que impulsa el movimiento de la plataforma robótica de diseño personalizado, la cual sostiene ocho placas.

Configure el juego de filtros para la detección de GFP seleccionando el conjunto de dos filtros para GFP con excitación a 480 nanómetros y emisión a 510 nanómetros en un microscopio estereoscópico MZ L tres. A continuación, esterilice las tapas gruesas de policarbonato de la placa de Petri rociándolas con etanol al 70%. Las tapas especializadas utilizadas para cubrir la base de la placa de Petri evitan la condensación durante la recopilación de imágenes.

Coloque las placas que contienen el cuan bombardeado en la plataforma de robótica y apriete el tornillo de fijación lateral para asegurarlas en su posición. Ahora abra la aplicación de software personalizada que controla tanto la plataforma de robótica como la adquisición de imágenes. Abra también el interruptor del controlador de luz blanca mediante el software y oriente la plataforma hacia la posición inicial.

Esto se realiza antes de ingresar las posiciones. Para cada entrada de coddle en la pestaña del motor, seleccione la primera placa. La plataforma colocará el centro de la placa de Petri bajo el objetivo del microscopio.

Utilice los botones de distancia de movimiento para posicionar con precisión el primer CU LEADIN para la recopilación de imágenes. Mediante la función de modo en vivo, mueva el cuddle leaden al área de visualización adecuada. Para el primer cuddle leaden, utilice los mandos manuales del microscopio estereoscópico para ajustar el enfoque y establezca la magnificación en 1,6 x. Una vez que se haya definido la región de interés, haga clic en el botón agregar esta posición.

El software agregará las coordenadas de esta región a un archivo de programa de posiciones y la plataforma regresará al centro de las posiciones establecidas en la placa para todos los coens restantes en las placas. Utilizando los botones de distancia de movimiento, use los tres tornillos de nivelación manual ubicados debajo de cada placa en la plataforma robótica para ajustar el enfoque del coan restante en la misma placa. Después de que se hayan ingresado todas las coordenadas de todos los coan, guarde las coordenadas del programa de posiciones.

Introduzca los parámetros de adquisición de imágenes, como el tipo de luz, que es azul para GFP, y la configuración de exposición, así como especifique dónde almacenar las imágenes, tal como se describe en el protocolo escrito adjunto. Vaya a la pestaña de control de tiempo de captura y establezca el intervalo de tiempo de adquisición de imágenes y el número total de ciclos de recopilación de imágenes. Normalmente, las imágenes se recopilan cada hora durante 100 horas.

Generación de perfiles de expresión génica bien definidos. Inicie la adquisición de imágenes abriendo la pestaña de programación de posiciones y luego haciendo clic en el botón de ejecutar programación. Aísle el sistema de recopilación de imágenes de la luz ambiental al final de la recopilación de imágenes de 100 horas.

Las imágenes de alta resolución, de aproximadamente cinco megabytes cada una, están listas para el análisis de imágenes. Utilice Image Ready para ensamblar las 100 imágenes secuenciales de cada carpeta. Importe todas las imágenes secuenciales como fotogramas y redimensione a 800 por 600 píxeles para acelerar el procesamiento de imágenes.

A continuación, utilice marcas en una nueva capa introducida, que sea visible en todos los fotogramas y emplee los puntos seleccionados de GFP como referencia de la imagen. Alinee manualmente cada imagen; cuando la alineación esté completa, elimine la capa utilizada como referencia y guarde el archivo como un único archivo PSD. Asimismo, exporte todos los fotogramas como un único archivo MOV utilizando la resolución más alta posible.

Los archivos ya están listos para comenzar la cuantificación de GFP. Utilice ImageJ para abrir el archivo MOV y recorte un área de 400 por 300 píxeles. Luego, separe las imágenes secuenciales en los canales rojo, azul y verde utilizando la herramienta de separación RGB para los canales rojo y verde.

Reste la fluorescencia de fondo utilizando la herramienta del complemento sustraer ROI medida para cada corte. Calcule la expresión de GFP ajustando los niveles de umbral y utilizando un complemento diseñado para medir el valor medio de escala de grises por píxel y el número total de píxeles que expresan GFP. Copie los valores de salida en ImageJ. Finalmente, pegue los valores de salida para los canales verde y rojo en Microsoft Office.

Excel para realizar un mayor procesamiento de datos y darle una idea de los resultados del alineamiento de imágenes. Esta primera animación muestra la inexactitud en la reposición de la plataforma robótica durante el experimento de 100 horas. El movimiento de los puntos es un artefacto que resulta de la incapacidad de la plataforma robótica para regresar exactamente a la misma posición en cada punto de tiempo tras el alineamiento manual de imágenes; las células que expresan GFP pueden observarse fácilmente y las características únicas de este sistema de seguimiento se visualizan con claridad.

Al repetirse esta animación, observe las células que expresan GFP y que están circuladas; la célula marcada con círculo rojo muestra una disminución muy rápida de la expresión entre las 18 y 20 horas posteriores al bombardeo, mientras que la célula marcada con círculo blanco muestra un inicio retardado de la expresión de GFP. Además de las animaciones, este procedimiento permite la cuantificación rápida de la expresión de GFP a lo largo del tiempo en el tejido objetivo del fríjol lima. Estos resultados representativos muestran la cuantificación comparativa de la intensidad de promotores utilizando el promotor CAMV 35S y cuatro promotores diferentes de soja.

Acabamos de mostrarle cómo introducir ADN en el catalín germinado. Las semillas de vena Lima colocan el catalín en el robot, capturan imágenes para análisis de imagen y analizan dichas imágenes. Utilizamos habitualmente este procedimiento en nuestro laboratorio para validar promotores de plantas clonadas.

Se puede generar una gran cantidad de datos a partir de la introducción de diferentes promotores vegetales. Sin embargo, este procedimiento es complicado y consta de muchos pasos que pueden fallar; al realizarlo, es importante comenzar con semillas frescas de frijol o, al menos, utilizar semillas de alta calidad que se hayan almacenado adecuadamente. También es fundamental colocar rápidamente la tapa cortada para el bombardeo y configurarla en el robot, y usar la tapa gruesa de la placa de Petri para minimizar los problemas de condensación.

Y por último, tenga en cuenta que la GFP que utilizamos es otra versión denominada SGFP, procedente del Gen HIN Lab de la Universidad de Harvard. Esta GFP no es muy estable y podría ser más adecuada para rastrear cambios rápidos en la expresión génica. Y eso es todo por nuestra parte para que nos hayan visto.

Y mucha suerte con sus experimentos.