Multicolor análisis de citometría de flujo de la respuesta inmune celular en macacos rhesus

Este video demuestra un procedimiento para estimular y teñir células mononucleares de sangre periférica o pbmc. Para el análisis de citometría de flujo multicolor, Alec Watts de pbmc aisladas de sangre completa se colocan en placas de cultivo celular. Las células se estimulan química o biológicamente para producir una respuesta inmunitaria.

Tras la estimulación, se añade un cóctel de anticuerpos para identificar los tipos celulares según los marcadores de superficie expresados. A continuación, las células se permeabilizan y se agrega un cóctel diferente de anticuerpos para detectar la expresión de citocinas intracelulares; luego, las células se analizan mediante citometría de flujo para determinar los perfiles de citocinas en subpoblaciones específicas de PBMC. Hola, soy Amy Courtney del laboratorio del Dr. Jagan Sadasivam en el Departamento de Inmunología del Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas.

Hola, soy Hong, también del laboratorio. Hoy les mostraremos un análisis de citometría múltiple de las respuestas de linfocitos T. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las respuestas inmunitarias celulares en Reus Maca.

Así que comencemos. Inicie este protocolo utilizando un hemocitómetro para determinar los recuentos de células viables de pbmc de Reuss Maca mediante el método de exclusión con el colorante Azul de Tripano. Trabaje en una cabina de flujo laminar reus.

Suspenda las células en medio completo a una concentración de 10 millones de células por mililitro para la estimulación no específica, colocando 100 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Luego, añada 100 microlitros de medio que contenga PMA y CIN para alcanzar un volumen total de 0,2 mililitros, con una concentración final de 50 nanogramos por mililitro de PMA y 500 nanogramos por mililitro de CIN; para los pocillos de control negativo, añada 100 microlitros de medio completo únicamente. Incube las células a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono durante 1,5 horas.

Añada felden A al cultivo a una concentración final de 10 microgramos por mililitro e incube durante 4,5 horas adicionales. El felden A se añade para atrapar citocinas en el aparato gold G con el fin de aumentar la visibilidad mediante tinción inmunológica; tras la estimulación, centrifugue para eliminar el medio y luego lave añadiendo 200 microlitros de tampón de lavado frío para citometría, y centrifugue a baja velocidad. Repita este lavado, luego resuspenda en 50 microlitros de tampón de lavado para citometría.

Las células ya están listas para ser marcadas para la expresión de marcadores de superficie en cada pocillo de las células resuspendidas. Añada un microlitro de colorante fluorescente fijable azul para células muertas, preparado según las instrucciones del fabricante y S. Incube a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 30 minutos mientras las células están incubando.

Prepare las soluciones de tinción que se utilizarán para los hechos en tubos micro. Primero, prepare un cóctel de marcado que incluya lo siguiente adecuadamente: anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia titulados, anti CD tres PE SCI siete, anti CD ocho Alexa 700, anti CD 28 per CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC y anti CD cuatro Pacific Blue en tampón de lavado por flujo.

A continuación, prepare controles de compensación, que se utilizarán para determinar los coeficientes de desbordamiento de cada tinción individual hacia otros detectores, preparando un tubo con cada anticuerpo conjugado fluorescentemente de forma individual como tinción monocromática. Finalmente, prepare tinciones de fluorescencia menos uno o FMO combinando todos los reactivos excepto el de interés. Esto se utilizará para determinar el límite entre una población positiva y negativa mediante la duplicación de los niveles de autofluorescencia y los datos presentes en muestras completamente teñidas.

Después de que las células hayan incubado en la tinción de viabilidad, lávese una vez con tampón de lavado frío para citometría para eliminar el colorante en exceso, aspire el tampón de lavado. Luego agregue las soluciones de tinción preparadas. Incube las células a cuatro grados Celsius en la oscuridad durante 30 minutos.

Lave las células teñidas con tampón de lavado frío para citometría de flujo para eliminar el exceso de anticuerpo. A continuación, agregue 100 microlitros de solución de fijación y permeabilización BD durante al menos 10 minutos. Almacene las células a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta por 24 horas hasta su uso, o continúe con la etiquetación de las citocinas intracelulares para marcar las citocinas intracelulares.

Primero permeabilice las células en 100 microlitros de perm al 1X. Incube con tampón de lavado durante 10 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad mientras las células están incubando. Prepare los anticuerpos de tinción, los controles de compensación y los controles FMO en tampón de lavado al 1X como antes.

Después de que las células se incuben durante 10 minutos, centrifugar y eliminar el tampón de lavado con x perm. Añadir los anticuerpos de tinción adecuados. Luego, incubar las células y los anticuerpos durante 60 minutos a cuatro grados Celsius en la oscuridad tras la incubación.

Lave las células dos veces con la solución de permeabilización. Después del lavado final, resuspenda las células en paraformaldehído al 1 % en DPBS para fijarlas. Almacene las células a cuatro grados Celsius en la oscuridad hasta su uso, durante un máximo de 24 horas.

Una vez que las células han sido marcadas, utilice un citómetro de flujo LSR two o un citómetro de flujo cyan a DP para realizar los análisis. Luego analice los datos utilizando FlowJo o software similar. La composición de PBMC en reuss Maca se determinó mediante análisis de fax.

Esta figura muestra el esquema de selección utilizado para el análisis de los diferentes subconjuntos de linfocitos T a partir de un animal representativo. Primero se seleccionaron los linfocitos mediante la dispersión directa FSC frente a la dispersión lateral SSC, y luego se identificaron los linfocitos viables en función de la SSC y la población negativa para AQUA. Las células T se identificaron posteriormente por la expresión de CD tres; asimismo, dentro de la población de células T positivas para CD tres, se determinaron las poblaciones positivas para CD cuatro y negativas para CD ocho, y las poblaciones negativas para CD cuatro y positivas para CD ocho.

Las células T CD4 positivas y CD8 positivas se distinguieron además en diferentes subpoblaciones según la expresión de CD28 y CD95 como células naïve, de memoria central y de memoria efectora. Esta figura muestra la producción de interferón gamma e IL-2 en células T CD4 positivas y sus subpoblaciones no estimuladas y estimuladas con PMA/CIN.

Observe los perfiles de citoquinas distintos provocados por la estimulación. En cada subconjunto. Tenemos que mostrarle cómo realizar el análisis de citometría de flujo múltiple de pbmc.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar configurar tanto los controles de compensación de un solo color como los controles de fluorescencia menos uno. Ambos controles son necesarios para un análisis adecuado de los datos de citometría de flujo. Consulte nuestro protocolo escrito para obtener más información sobre la selección de controles de compensación.

Además, recuerde que al usar un anticuerpo marcado con fluorescencia, es importante cubrir las muestras para protegerlas de la exposición a la luz. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.