Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Se introducen E Coli RP 4 37 en un dispositivo de quimiotaxis en el que se exponen a una concentración espacial definida. Los gradientes a los que las células se enfrentan al entrar en la cámara encuentran el punto medio del gradiente de concentración. Dependiendo de si la señal se percibe como un atrayente o un repelente, las bacterias se desplazan rápidamente hacia arriba o hacia abajo según el gradiente de concentración.

Hola, soy Derek Engler del Laboratorio de Biotecnología Molecular de Sistemas y del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para investigar la quimiotaxis bacteriana en un dispositivo microfluídico. Utilizamos este procedimiento en nuestros laboratorios para estudiar cómo E. coli RP437 migra en un gradiente de concentración de sulfato de níquel.

Así que comencemos. La capa fluidica y la capa de control se fabrican mediante moldeo por réplica de Polymethyl SUBOXANE o PDMS a partir del molde maestro SU ocho. Para iniciar este procedimiento, mezcle el prepolímero de PDMS y el agente de reticulación en una proporción de 10 a 1 en peso.

Degase la mezcla en un desecador durante una hora hasta que se eliminen las burbujas de aire. Cuando la mezcla de PDMS esté lista, coloque el molde maestro SU-8 en una placa de Petri y vierta cuidadosamente la mezcla sobre el molde maestro SU-8 hasta alcanzar el grosor deseado. Incube la placa de Petri que contiene el PDMS y el molde maestro SU-8 a 80 grados Celsius durante dos horas para curar el PDMS.

Después de dos horas, retire el PDMS curado cubierto con el molde maestro SU-8 de la placa calefactora y despegue el molde de PDMS del molde maestro SU-8. La estructura deseada quedará incrustada en el molde de PDMS; utilice una aguja romo de calibre 20 para perforar cuatro orificios en el molde de PDMS para conectar los tubos al generador de gradientes, la entrada celular y la salida celular. Ahora estamos listos para ensamblar el dispositivo de PDMS y unirlo.

Primero, limpie una placa de microscopio de vidrio con isopropanol y séquela con una corriente de aire. A continuación, exponga el molde de PDMS y la placa de vidrio al plasma de oxígeno en un grabador de plasma durante aproximadamente 30 segundos. Ponga en contacto el molde de PDMS con la placa de vidrio. Caliente la placa y el molde de PDMS en contacto sobre una placa calefactora a 65 grados Celsius durante 15 minutos.

Para ensamblar el dispositivo de PDMS, use una cuchilla para cortar el tubo en un ángulo de 45 grados a la longitud correcta necesaria según el equipo del microscopio. Luego, usando pinzas, inserte un extremo del tubo en uno de los cuatro orificios perforados en el dispositivo.

Inserte el casquillo de una aguja roma de calibre 30 en el otro extremo del tubo. Repita la inserción del tubo y el casquillo de la aguja en todos los orificios restantes. Cargue un mililitro de quimiotácticos, tampón o CB en una jeringa de tres mililitros.

Teniendo cuidado de eliminar el aire de la jeringa. Añada CB al conector de la aguja de salida mediante una pipeta y golpee suavemente el conector para eliminar cualquier burbuja de aire. Exprese un poco de CB desde la punta de la jeringa de tres mililitros y conecte la jeringa al conector de la aguja sin atrapar aire.

Empuje el CB a través del dispositivo hasta que todas las conexiones restantes de la aguja estén llenas de CB. Esto debería eliminar la mayor parte de las burbujas de aire. A continuación, llene dos jeringas de 500 microlitros con CB que contenga las concentraciones adecuadas del efector químico que se está probando.

Elimine la formación de burbujas de aire expulsando una pequeña gota del contenido de la jeringa y tocando las gotas del líquido en el cono de la aguja, y luego fije la jeringa para preparar bacterias altamente móviles. Para el experimento de quimiotaxis, cultive una cultura nocturna de Escherichia coli RP437 con expresión de GFP, con plásmido en caldo triptona o TB a 32 grados Celsius con agitación. Al día siguiente, utilice la cultura nocturna para inocular un cultivo de 20 mililitros de TB en un matraz Erlenmeyer de 250 mililitros hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nanómetros de aproximadamente 0,05.

Cultive la muestra a 32 grados Celsius con agitación cuando las células tengan una DO 600 de aproximadamente 0,35 a 0,45. Recójalas mediante centrifugación a baja velocidad y resuspenda las células hasta una DO 600 de aproximadamente 0,35 en CB que contenga el efecto químico a la concentración esperada en el centro del canal. Finalmente, agregue células muertas marcadas con RFP a una DO 600 de aproximadamente 0,35 a las células vivas que expresan GFP.

Estas células muertas servirán como control interno para asegurar que cualquier migración no se deba a efectos de flujo. La suspensión celular ya está lista para cargarse en el dispositivo microfluídico para el experimento de quimiotaxis. Para comenzar el experimento de quimiotaxis, retire algo del CB del conector de la aguja de entrada celular y rellene con la suspensión celular.

Llene suavemente una jeringa de 50 microlitros con las células resuspendidas. Hágalo lentamente, ya que los flagelos pueden romperse, lo que reducirá la motilidad. Conecte la jeringa de 50 microlitros al conector de entrada de la aguja como se mostró anteriormente, expulsando una pequeña gota del contenido de la jeringa y tocando con ella el líquido dentro del conector de la aguja; luego, fije la jeringa y coloque el dispositivo sobre la platina de un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la adquisición de imágenes.

Coloque ambas las jeringas de entrada en la bomba de jeringas e inicie el flujo de manera que se forme el gradiente y las células fluyan a través del tubo. Una vez que las células entren en la cámara de quimiotaxis, espere aproximadamente 20 minutos para que el sistema se estabilice. Antes de la adquisición de imágenes, obtenga imágenes de fluorescencia en vivo en color verde e imágenes de muerte celular en color rojo en diferentes ubicaciones a lo largo de la longitud de la cámara.

Típicamente recolectamos 100 imágenes en cada ubicación a intervalos de tres segundos. Las imágenes de fluorescencia adquiridas pueden analizarse utilizando cualquier programa comercial de análisis de imágenes, como Image J o Metamorph, o mediante códigos sencillos escritos en MATLAB. En este ejemplo, utilizaremos códigos de MATLAB.

Comience por eliminar los píxeles de fondo en la imagen mediante este umbral establecido de intensidad de píxeles, y elimine todos los píxeles que tengan una intensidad menor que el umbral. Esto minimiza el ruido. En el análisis, utilice la posición de las células muertas para determinar el centro de la imagen.

Esta es la posición en la que las células ingresaron a la cámara de quimiotaxis y en la que se detectarían en ausencia de cualquier migración. A continuación, localice las células vivas en la imagen, divida la imagen en canales y determine el número de células vivas en cada canal. En nuestros trabajos previos, la cámara de quimiotaxis de 10 a 50 micrómetros de ancho se dividió en 64 canales, cada uno con aproximadamente 16 micrómetros de ancho.

Después de repetir estos pasos para todas las imágenes, se obtienen algunos de los recuentos totales de células para cada canal en todas las imágenes. Esto proporciona el recuento total de células detectadas en cada canal durante la duración del experimento. Calcule las quimiotaxis, el coeficiente de partición o CPC, que representa la dirección de la migración.

Al realizar los siguientes pasos, asigne un multiplicador de más uno y menos uno a cada célula ubicada en el lado de alta concentración o derecho y en el lado de baja concentración o izquierdo de las células muertas, respectivamente. Sume todos los valores multiplicados y normalice según el número total de células detectadas. Calcule la quimiotaxis, el coeficiente de migración o CMC, que pondera la migración de las células según la distancia recorrida.

Una célula que se desplaza al canal de la posición de mayor concentración más alejada, el 64, recibe un factor de ponderación de más uno, mientras que una célula que avanza hasta la mitad del lado de mayor concentración recibe un factor de ponderación de más 0,5. El movimiento hacia la posición de menor concentración más alejada se pondera con menos uno. La suma de todos los recuentos celulares ponderados se normaliza respecto al número de células para generar el CMC.

Este gráfico muestra un gradiente de concentración lineal o perfil formado en el dispositivo microfluídico utilizando isotiocianato de fluoresceína. La formación de un gradiente de concentración se demuestra en esta figura usando colorantes azul y amarillo. La entrada celular fue CA para que no hubiera flujo a través de ella, y se puede observar que se forma una gama de colores entre azul y amarillo.

A continuación se muestran imágenes en pseudocolor de un experimento representativo de quimiotaxis en el que E. coli RP437 fue expuesto a un gradiente de cero a 100 micromolares de L-aspartato o de cero a 225 micromolares de sulfato de níquel en el dispositivo. La migración de las bacterias verdes vivas hacia el L-aspartato o alejándose del níquel se registró cada 2,5 segundos durante 30 minutos. Las bacterias muertas, mostradas en rojo, sirvieron como control para los efectos de flujo en el dispositivo.

La distribución espacial de RP 4 37 en el dispositivo microfluídico en ausencia de un gradiente se muestra en esta gráfica en comparación con su respuesta a un gradiente de aspartato y un gradiente de sulfato de níquel. Acabamos de mostrarle cómo monitorear las quimiotaxis de E. coli RP 4 37 en un gradiente de sulfato de níquel. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar el remolino de las células para poder utilizar una subpoblación con alta movilidad.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.