A simple fenotipo compuesto el sistema de puntaje para la evaluación de modelos de ratón de Ataxia cerebelosa

Hemos desarrollado un sistema de puntuación de fenotipo compuesto para la evaluación de la gravedad y progresión de la enfermedad. En modelos murinos de ataxia cerebelosa, realizamos cuatro pruebas diferentes: la prueba del borde, el agarre de las extremidades traseras, la marcha y la cifosis, utilizando una escala de cero a tres para cada prueba, con una puntuación combinada de cero a 12. De las cuatro mediciones, la prueba del borde sirve para medir directamente la coordinación.

El encogimiento de las extremidades posteriores es un indicador de la progresión de la enfermedad en varios modelos de ratón de neurodegeneración. La marcha es una medida de la coordinación y la función muscular. La cifosis es la curvatura de la columna vertebral en la región cervicotorácica, común en modelos de ratón de neurodegeneración del sistema motor y cerebelosa espinal que realizan cada prueba y registran la puntuación.

Se calcula la suma promedio de los cuatro puntajes o el puntaje fenotípico compuesto promedio para cada grupo de ratones y se representa gráficamente. Al aplicar este protocolo a diferentes modelos de ratones, es importante analizar primero los puntajes de las pruebas individuales para determinar la combinación ideal de las cuatro medidas descritas. Este protocolo específico fue diseñado para discriminar entre individuos afectados y no afectados, y también para cuantificar la progresión del fenotipo de la enfermedad en modelos de ratón de ataxia cerebelosa espinal.

Tipo siete. Hola, soy Stephanie Fur del laboratorio de la Dra. Gwen Garden en el Departamento de Neurología de la Universidad de Washington. Hoy les mostraremos un método sencillo y sensible para evaluar la gravedad de la enfermedad en modelos murinos de ataxia cerebelosa.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para cuantificar las diferencias fenotípicas en modelos murinos de ataxia cerebelosa espinal tipo siete o SCA siete, y para seguir la progresión del fenotipo SCA siete a lo largo del tiempo. Comencemos. La prueba de la repisa es una medida directa de la coordinación, que se encuentra afectada en las ataxias cerebelosas y muchas otras enfermedades neurodegenerativas.

Esto mide los signos más directamente comparables a los de ataxia cerebelosa humana para evitar sesgos. El experimentador que realice las evaluaciones no debe tener conocimiento del genotipo del animal. Durante las evaluaciones, cada medida individual se puntúa en una escala de cero a tres, donde cero representa la ausencia del fenotipo y tres representa su manifestación más grave.

Comience levantando al ratón de la jaula y colóquelo sobre el borde de la jaula. Observe al ratón mientras camina a lo largo del borde de la jaula y se introduce nuevamente en ella. Un ratón de tipo silvestre caminará a lo largo del borde sin perder el equilibrio y se introducirá de vuelta en la jaula con gracia utilizando sus patas.

A este comportamiento se le asigna una puntuación de cero. Si el ratón pierde el equilibrio mientras camina por el borde, pero de resto parece coordinado, recibe una puntuación de uno. Si no utiliza eficazmente las patas traseras o no puede bajar con gracia dentro de la jaula.

Recibe una puntuación de dos si cae del borde o casi cae mientras camina o intenta bajarse, o si tiembla y se niega a moverse por completo. A pesar del estímulo, recibe una puntuación de tres. Realice la prueba del borde tres veces para asegurar una medición precisa y registre la puntuación obtenida en la prueba del borde.

Ahora veamos cómo puntuar el agarre de las extremidades traseras. El agarre de las extremidades traseras es un marcador de la progresión de la enfermedad en varios modelos de ratón de neurodegeneración, incluidas ciertas ataxias cerebelosas. Para comenzar la evaluación, sujete la cola cerca de su base y levante al animal, evitando cualquier otro objeto circundante.

Observe la posición de las extremidades posteriores durante aproximadamente 10 segundos. Si las extremidades posteriores están consistentemente separadas hacia fuera, alejadas del abdomen, se le asigna una puntuación de cero. Si una extremidad posterior se retrae hacia el abdomen durante más del 50 % del tiempo suspendido, recibe una puntuación de uno.

Si ambas extremidades traseras están parcialmente retraídas hacia el abdomen durante más del 50 % del tiempo suspendido, se le asigna una puntuación de dos. Si las extremidades traseras están completamente retraídas y en contacto con el abdomen durante más del 50 % del tiempo suspendido, se le asigna una puntuación de tres. Realice la prueba tres veces y registre la puntuación del reflejo de flexión de las extremidades traseras.

Ahora veamos cómo evaluar la marcha. La prueba de la marcha es una medida de la coordinación y la función muscular. Para comenzar la prueba, retire el ratón de su jaula y colóquelo sobre una superficie plana con la cabeza orientada en dirección opuesta al investigador.

Observe el ratón desde atrás mientras camina. Si el ratón se mueve normalmente con el peso de su cuerpo sostenido por todas las extremidades, con el abdomen sin tocar el suelo y ambas extremidades traseras participando de manera uniforme, recibe una puntuación de cero. Si presenta un temblor o parece cojear al caminar, o si sus pies están ligeramente desviados hacia afuera respecto al cuerpo, recibe una puntuación de uno.

Si presenta un temblor severo, cojera severa, pelvis caída o los pies apuntan más marcadamente hacia afuera del cuerpo durante la locomoción, se le asigna un dos. Si el ratón tiene dificultad para moverse hacia adelante y arrastra su abdomen sobre el suelo, recibe un tres. Observe la marcha del ratón tres veces y registre la puntuación de deslizamiento.

Ahora veamos. La prueba de cifosis, la cifosis es una curvatura dorsal característica de la columna vertebral. Esta es una manifestación común de enfermedades neurodegenerativas que afectan a los sistemas motores, incluidas las ataxias espino-cerebelosas en modelos de ratón.

Es causado por una pérdida del tono muscular en los músculos espinales secundaria a la neurodegeneración. Para comenzar, retire al ratón de su jaula y colóquelo sobre una superficie plana. Obsérvelo mientras camina.

Si el ratón es capaz de enderezar fácilmente su columna vertebral al caminar y no presenta cifosis persistente, recibe una puntuación de cero. Si el ratón presenta cifosis leve pero es capaz de enderezar su columna vertebral, recibe una puntuación de uno. Si no puede enderezarla completamente y mantiene una cifosis persistente, aunque leve, recibe una puntuación de dos.

Si el ratón mantiene una cifosis pronunciada mientras camina o cuando está sentado, se le asigna una puntuación de tres. Observe la puntuación de cifosis del ratón tres veces. Devuelva al ratón a su jaula y registre su puntuación de cifosis.

A continuación se muestra una gráfica representativa de la evaluación del fenotipo compuesto en un modelo transgénico murino de ataxia espino-cerebelosa tipo siete conocido como SCA7 92Q agrupado. Se sumaron las puntuaciones de las cuatro mediciones para cada ratón, y se calculó la puntuación compuesta promedio para ambos genotipos a cada edad. Aquí, los ratones SCA7 92Q agrupados presentan un fenotipo progresivo de SCA7 que es significativamente diferente al de sus camadas no transgénicas. Es importante destacar que el aumento de la puntuación fenotípica con el tiempo es consistente con la naturaleza progresiva de la enfermedad humana.

Acabamos de mostrarle cómo utilizar un sistema de puntuación de fenotipo compuesto para evaluar la gravedad y la progresión de la enfermedad en modelos murinos de ataxia cerebelosa. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la obesidad es un factor de confusión en las cuatro pruebas descritas. Los resultados de las pruebas individuales pueden analizarse por separado para determinar primero su combinación ideal en un sistema de puntuación de fenotipo compuesto, más adecuado para su modelo murino.

Así es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.