Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Este protocolo utiliza un promotor regulable que permite la expresión controlada de proteínas. En este experimento, utilizamos un plásmido de dos micrones de alta copia que expresa el dominio N dos a partir de un promotor represible por metionina. Se transforman células de levadura silvestres con este plásmido.

Los plásmidos y los transformantes se seleccionan en placas que carecen de uol. Después del crecimiento nocturno, las células se sincronizan mediante un arresto del crecimiento mediado por la ausencia de cortisol.

Finalmente, la expresión se induce transfiriendo las células a un medio careciente de metionina durante el experimento de curso temporal. La concentración de proteína se monitorea mediante inmunotransferencia y el desarrollo del fenotipo morfológico mediante microscopía. Hola, soy Claudia del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad Purdue.

Soy de Bari Muji en el alar y soy también del laboratorio AL. Hoy les mostraremos un procedimiento para el análisis del desarrollo de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteína en el cuerpo inductivo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los aspectos morfológicos y moleculares de un fenotipo de división celular observado tras la sobreexpresión del dominio N dos de la proteína adaptadora endocítica ausente dos.

Así que comencemos. Este protocolo comienza con la construcción de una cepa de levadura que expresará su proteína de interés. En nuestro caso, transformamos la cepa de levadura tipo silvestre W 3 0 3 con ADN plasmídico de alta copia que contiene nth2 bajo el control del promotor represible por metionina; dos milimolar de metionina suprime la actividad del promotor met25.

Aunque el medio sin metionina permite una expresión máxima, seleccione seis colonias de una placa que contenga células recién transformadas e inocule en 50 mililitros de medio selectivo con 0,2 milimolar de metionina en un matraz cónico; incube durante la noche a 30 grados Celsius con agitación a 200 RPM. A la mañana siguiente, estime la densidad celular midiendo la densidad óptica del cultivo a 600 nanómetros. Transfiera el equivalente de 20 OD a 600 nanómetros por mililitro de células a un tubo de centrífuga estéril y recupere mediante centrifugación.

Re-suspender las células en medio YPD mediante vortex para sincronizar el ciclo celular hasta una concentración final de 15 microgramos por mililitro a partir de un stock de un miligramo por mililitro en DMSO. Incubar durante cuatro horas a 30 grados Celsius con agitación a 200 RPM. Después de cuatro horas, verificar el porcentaje de células arrestadas en mitosis.

Al observar al microscopio y contar el número de células con brotes de tamaño igual, proceda al siguiente paso. Solo si el arresto es mayor al 90 %, recopile las células por centrifugación a 2200 RPM durante cinco minutos. Después de tres lavados con agua fría, resuspenda el precipitado en medio selectivo que carezca de metionina a una densidad celular de aproximadamente 0,5 OD a 600 nanómetros por mililitro.

Transfiera la mitad del volumen de células a un nuevo tubo estéril y agregue metionina hasta una concentración final de 0,2 milimolar. Esto servirá como control para los efectos debidos a los niveles basales de expresión proteica. Devuelva ambas culturas al incubador a 30 grados Celsius.

Las células se analizan para evaluar el desarrollo del fenotipo cada hora durante seis horas en cada momento. Transfiera puntualmente un mililitro de la suspensión celular de cada cultivo a un tubo microfuge estéril y recopile las células mediante centrifugación, aspire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 70 microlitros de medio. A continuación, agregue 30 microlitros de azul de metileno proveniente de un stock de un miligramo por mililitro en agua estéril.

A continuación, pipetee aproximadamente seis microlitros de esta suspensión sobre un portaobjetos limpio y coloque un cubreobjetos sobre la gota. Presione suavemente el cubreobjetos para formar una capa fina y uniforme de células entre las superficies de vidrio. Divida el cubreobjetos en nueve cuadrantes y tome tres imágenes por cuadrante.

El número de células por campo no debe ser mayor de 30 células para permitir una cuantificación precisa. Cuente el número de células que presentan el fenotipo bajo estudio, que en este ejemplo son células de levadura en gemación con brotes alargados y/o concatenados que no logran separarse entre sí. También contamos el número de células muertas identificadas por su color azul, ya que el defecto en la división celular inducido tras el nth.

La sobreexpresión conduce a la muerte celular para visualizar defectos fenotípicos específicos en cada momento. Tome una alícuota de un mililitro de cultivo en un tubo microfuga estéril y recupere las células mediante centrifugación. Suspender el sedimento celular en 100 microlitros de solución Calcofluor blanco al uno miligramo por mililitro en agua estéril e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

La tinción con blanco de calcio permite la visualización de la pared celular. Lave el sedimento tres veces con un volumen de PBS 1X. Suspendemos el sedimento final en 100 microlitros de PBS.

Observe las células bajo el microscopio y adquiera imágenes a 100 x de magnificación utilizando óptica UV para visualizar la pared celular. Para visualizar la septina marcada con GFP, adquiera imágenes utilizando un filtro FS E. Cuantifique el porcentaje de células con defectos en la pared celular y mala localización de la septina utilizando el método mostrado anteriormente, dividiendo el cubreobjetos en nueve cuadrantes y tomando tres imágenes por cuadrante para el recuento en video de lapso de tiempo. La microscopía de células individuales de levadura requiere camas de agarosa embebidas en medio para hacer una cama de agarosa.

Primero limpie un portaobjetos de vidrio con una depresión cóncava usando alcohol al 70 % y déjelo secar al aire mientras el portaobjetos se seca. Hierva 0,06 gramos de agros en cinco mililitros de medio selectivo sin metionina en un horno microondas hasta que el agros se disuelva completamente y rápidamente. Transfiera con pipeta 200 microlitros del medio que contiene agros al portaobjetos.

Presione e invierta otra portaobjetos de vidrio limpia sobre ella, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas debajo. Cuando el gel se solidifique, retire suavemente la portaobjetos superior alejándola de la portaobjetos de depresión, manteniendo siempre sus superficies paralelas. Esto garantiza que la superficie del lecho de agarosa quede al ras con la superficie de la portaobjetos de depresión.

Limpie la región de la placa que rodea el lecho de agros con un tejido delicado. La placa ya está lista para usar a las cuatro horas. Transfiera un mililitro de células del cultivo a un tubo microfuge estéril y recupere mediante centrifugación.

Aspire el sobrenadante y resuspenda las células en 100 microlitros de medio selectivo fresco sin metionina. Aplique vaselina en los bordes del cubreobjetos. Luego coloque una gota de suspensión celular en el centro del lecho de agarosa y extiéndala uniformemente presionando suavemente un cubreobjetos sobre ella.

Selle los bordes del cubreobjetos y fije su posición aplicando esmalte de uñas alrededor de los bordes. Una vez que el esmalte de uñas esté seco, coloque el portaobjetos sobre la platina calentada de un microscopio. Utilizamos un microscopio Zeiss Axio 200 M equipado con una cámara digital monocromática Zeiss Axio camm, MRM para seleccionar un campo que contenga no más de 10 células espaciadas adecuadamente, ya que con el tiempo el campo se volverá más denso.

A medida que las células se dividen, tome una imagen del campo cada cinco minutos durante aproximadamente cinco horas. Con el fin de evitar tener que reajustar el enfoque repetidamente, programamos el software de adquisición de imágenes para adquirir automáticamente varias imágenes de Zack en cada punto temporal.

Posteriormente, se seleccionará la imagen con el mejor enfoque para armar la película con el fin de garantizar un calor adecuado para las células; como fuente de calor externa adicional a las platinas calefaccionadas, se puede dejar la luz blanca transmitida del microscopio encendida durante toda la duración de la adquisición de imágenes. La regresión del fenotipo puede estudiarse ensamblando las imágenes en una película utilizando el software Image J. Aquí mostramos resultados representativos de la sobreexpresión de nuestra proteína de interés. Nth dos.

Primero, la expresión proteica de nth dos. Durante el curso temporal del experimento, se determinó que los lisados de células que expresan HA nth dos fueron analizados mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo monoclonal anti HA, como se muestra en el inmunoblot. Las células cultivadas en presencia de 0,2 milimolar de metionina presentan una expresión proteica mínima. Sin embargo, las células cultivadas en medio careciente de metionina muestran un aumento constante en la concentración de S dos a lo largo del curso temporal del experimento.

A continuación, se analizaron células cultivadas en presencia o ausencia de metionina durante seis horas, ya que una baja concentración de nth dos no es capaz de inducir un fenotipo de división celular o muerte celular únicamente. Un bajo porcentaje de células están muertas, como lo indica su color azul tras la tinción con azul de metileno. Asimismo, el número de núcleos por célula, así como la organización de la pared celular y de las septinas, son normales, tal como se esperaba.

En contraste, la sobreexpresión de M dos conduce a un defecto masivo en la división celular y a muerte celular, como se demuestra mediante largas cadenas de brotes alargados conectados que conservan el color azul al teñirse con azul de metileno. La mayoría de las células fenotípicas son multinucleadas, según lo indicado por la tinción con DPI. La tinción con blanco de calco muestra acumulaciones de parches anormales en la pared celular.

Además, la septina está gravemente mal localizada y desorganizada. La cuantificación del fenotipo en función del tiempo se muestra en esta gráfica, donde los círculos abiertos representan metionina cero milimolar y los círculos cerrados representan metionina 0,2 milimolar. Aquí observamos que, a medida que la concentración de nth dos aumenta en las células con el tiempo, el porcentaje de células que presentan el fenotipo de división celular también aumenta.

Las células de control cultivadas con 0,2 milimoles de metionina muestran que el desarrollo del fenotipo depende de la concentración elevada de proteína y no de las condiciones del cultivo celular. Finalmente, el desarrollo del fenotipo tras la sobreexpresión de Nth2 se registra mediante microscopía de video con lapso de tiempo.

Después de cuatro horas de nth, dos células con sobreexpresión muestran un fenotipo leve de división celular en la morfología. A medida que avanza la película, observamos períodos anormales y prolongados de crecimiento del brote apical, lo que da lugar a brotes muy alargados. También observamos eventos de aparición de nuevos brotes antes de que haya ocurrido un evento de separación celular.

Además, se observa que las yemas emergen de varias regiones de la célula madre, dando lugar a una apariencia ramificada. Acabamos de mostrarle cómo caracterizar y analizar el desarrollo de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteína en la lista de brotación. Al realizar este procedimiento, es importante recordar manipular las células a las velocidades de centrifugación recomendadas, ya que velocidades más altas podrían dañar las células.

También es importante recordar añadir azul de metileno y cloruro justo antes de la adquisición de imágenes, ya que son tóxicos para las células light east. Así que gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.