Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

El Sistema de Identificación de Especies de Peces es un método basado en ADN simple, rápido y preciso para identificar las especies de peces presentes en una muestra determinada. Las muestras de pescado se tratan con proteinasa K para liberar los ácidos nucleicos en solución. Luego, se aísla el ADN genómico del pescado y se amplifica mediante PCR utilizando cebadores que se unen a secuencias presentes en todos los genomas de peces.

Los productos de PCR se digieren luego con tres enzimas de restricción diferentes y se separan en el bioanalizador Agilent 2100. Las longitudes de los fragmentos generados en las reacciones de digestión pueden utilizarse para determinar la especie de pescado mediante el análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, o software de coincidencia de patrones RFLP. Hola, soy Rachel Formosa de Agilent Technologies.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la identificación de especies de peces basado en el ADN. Este procedimiento es un método de tamizaje que permite identificar las especies de peces presentes en muestras frescas, congeladas, molidas, cocidas, desecadas o de otro modo procesadas. Y esto puede lograrse en menos de un día laborable.

Utilizamos este procedimiento para estudiar la autenticidad de los productos del mar, lo cual es muy importante para la industria pesquera, ya que la sustitución y la etiquetación incorrecta pueden tener consecuencias económicas, ambientales y de seguridad alimentaria significativas. Además, puede ser especialmente difícil determinar la especie de pescado mediante identificación visual y otros métodos tradicionales. Una vez que el pescado ha sido procesado, el análisis de ADN proporciona un resultado mucho más preciso y confiable.

Así que comencemos. Comience a preparar las muestras para la extracción de ADN colocando de 10 a 1000 miligramos de cada muestra de tejido de pescado crudo o cocido en tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros para cada pescado. Añada 220 microlitros de solución recién preparada de proteinasa K y pipetee hacia arriba y hacia abajo.

Incube los tubos a 65 grados Celsius durante 10 minutos; tras la incubación, centrifugue durante tres a cinco minutos a 14.000 Gs para formar un pellet con cualquier tejido no digerido. A continuación, transfiera cuidadosamente 150 microlitros de cada sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 mililitros, evitando cualquier material no digerido en el fondo y el material aceitoso presente en la parte superior. El sobrenadante se utilizará ahora para la extracción de ADN genómico.

Comience la extracción de ADN genómico añadiendo 500 microlitros del tampón de unión de ácidos nucleicos a cada muestra. Esto elevará el volumen total de la muestra a 650 microlitros. Agite la muestra en vórtex hasta homogeneizarla.

A continuación, transfiera cada muestra a una columna de unión al ADN colocada en uno de los tubos receptores de dos mililitros proporcionados en el kit. Enrosque la tapa del tubo en la parte superior de la columna. Centrifugue las muestras durante un minuto a 14.000 G para cargar el ADN en la matriz de la columna.

Después de la centrifugación, retire los tubos de centrifugación, deseche el filtrado y coloque los tubos nuevamente en los tubos receptores. Añada 500 microlitros de tampón de lavado con alta salinidad 1x. Tape los tubos y centrifugue nuevamente tras la centrifugación.

Deseche el filtrado y coloque nuevamente las cápsulas de centrifugación en los tubos receptores. A continuación, agregue 500 microlitros de etanol al 80 %. Tape el tubo y centrifugue a 14.000 Gs durante un minuto.

Repita el lavado con etanol otras dos veces tras el tercer lavado con etanol al 80 %, deseche los filtrados. Vuelva a colocar los vasos de centrifugación en los tubos receptores y, esta vez, centrifugue durante dos minutos para secar la matriz de fibras. A continuación, transfiera los vasos de centrifugación a tubos colectores de 1,5 mililitros.

Añada 100 microlitros de tampón de evolución a cada cubeta de centrifugación directamente sobre la matriz de fibra dentro de la cubeta. Luego, coloque las tapas de los tubos de recolección en las cubetas de centrifugación y incúbelas a temperatura ambiente durante un minuto. Tras la incubación, centrifugue las muestras a velocidad máxima durante un minuto.

A continuación, deseche el vaso de centrifugación y tape los tubos. Se esperan concentraciones de ADN medidas en un rango de cinco nanogramos por microlitro a 500 nanogramos por microlitro. El ADN ya puede almacenarse a cuatro grados Celsius durante hasta un mes; para almacenamiento a largo plazo, coloque el ADN a menos 20 o menos 80 grados Celsius.

Realice una PCR utilizando los cebadores y los reactivos proporcionados en el kit de reactivos de P-C-R-R-F-L-P. Según el protocolo escrito adjunto, se recomienda correr cada muestra, incluyendo el control positivo y el control sin molde, en duplicado mientras se lleva a cabo la PCR. Prepare mezclas maestras de enzimas de restricción para las digestiones con DTE E uno HAE tres y NL tres combinando los siguientes componentes en orden: 1,5 microlitros de agua destilada estéril, 0,5 microlitros de tampón para enzima 10 x y 0,5 microlitros de enzima 10 x.

Prepare suficiente para todas las muestras más un volumen de reacción adicional de la mezcla de reactivos fourex three. Luego, distribuya 2,5 microlitros en cada tubo de reacción etiquetado con el nombre de la muestra y de la enzima. Una vez finalizada la PCR, retire las muestras del termociclador y colóquelas en hielo.

Añada 2,5 microlitros de cada producto de PCR a cada uno de los tres tubos de digestión con enzimas de restricción para esa reacción. DDE uno, HAE tres y NLA tres. A continuación, vortex.

Centrifugar brevemente e incubar las digestiones a 37 grados Celsius durante dos horas. Si resulta más conveniente, las digestiones también pueden incubarse durante la noche. Después de la digestión, incubar las reacciones a 65 grados Celsius durante 15 minutos.

Luego, agregue un microlitro de EDTA 60 milimolar a cada tubo para finalizar la reacción y vortexee. Utilizando el kit de reactivos del bioanalizador de Agilent, prepare y cargue la digestión con enzima de restricción en los pocillos de un chip de ADN según las instrucciones del kit. Para cada muestra, los tres digestiones deben cargarse en el mismo chip.

Luego, agite el chip mediante vortex y colóquelo en la máquina. Una vez finalizada la corrida, vaya al contexto del ensayo y seleccione la pestaña de resumen del chip. En el campo de nombre de la muestra, ingrese un nombre de muestra para los 12 pocillos del chip a fin de identificar la especie de pez de las muestras de ADN en prueba.

Inicie el programa decodificador de RFLP haciendo clic en archivo. Luego abra el archivo XAD. Aparecerá el cuadro de diálogo de apertura.

Ahora seleccione el archivo XAD para el chip de ADN utilizado. Haga clic en abrir para ver una lista de las muestras cargadas en el chip. Seleccione las tres digestiones correspondientes a la primera muestra de ADN.

En la columna de enzima, especifique las enzimas de restricción que se utilizaron en el campo etiquetado como altura mínima del pico como porcentaje del marcador inferior. El valor predeterminado es 10 % si es necesario. Este valor puede reducirse para identificar picos pequeños que se hayan pasado por alto, o aumentarse para descartar picos resultantes de ruido no específico en el electroferograma.

Después de realizar ajustes en el valor de altura mínima del pico, haga clic en reintegrar. A continuación, haga clic en calc en la parte inferior del cuadro de diálogo. Los datos de longitud de fragmento obtenidos del análisis en el bioanalizador completarán los campos del software.

A continuación, en la lista desplegable de puntuación ubicada en la esquina superior izquierda de la pantalla, seleccione dados. Si la muestra de pescado consiste en una única especie de pescado o en una mezcla, y si la muestra podría consistir en una mezcla, aparecerá la tabla en la parte inferior de la pantalla etiquetada como lista de puntuaciones combinadas. Las mejores coincidencias de especies se basan en los resultados de las tres reacciones de digestión.

Los coincidencias perfectas con una puntuación de uno se resaltan en verde. Las coincidencias cercanas se resaltan en amarillo en la parte superior de la pantalla. El valor de corte inferior designa el tamaño mínimo del fragmento utilizado en el análisis, y el valor de tolerancia de coincidencia determina cuán cercano en longitud debe ser un fragmento al fragmento predicho para considerarse una coincidencia.

Los valores mostrados son los ajustes predeterminados y pueden modificarse. Repita estos pasos para el análisis de las muestras de ADN restantes en la punta. Se aislaron, amplificaron y digirieron muestras de ADN de cuatro especies diferentes de peces utilizando el método descrito en este video.

Se muestra aquí un gel de bioanalizador con las muestras de digestión de restricción utilizando el Bioanalyzer de Agilent y el decodificador RFLP. Se utilizan patrones de plegamiento del software para identificar los peces aquí. La primera muestra se identifica correctamente como trucha, la segunda como atún, la tercera como pez roca.

Y la última muestra como bacalao específico. Acabamos de mostrarle cómo realizar la identificación de especies de pescado basada en ADN utilizando el método P-C-R-R-F-L-P de Agilent. Al realizar este procedimiento, es importante evitar la contaminación cruzada de las muestras, ya que el método es muy sensible.

Así que eso es todo. Ahora ya sabe cómo identificar rápidamente, con facilidad y precisión, las especies de peces presentes en sus muestras. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.