Microscopía óptica de dispersión basado en dos dimensiones filtros Gabor

En este video, se utiliza la microscopía de dispersión óptica para cuantificar la fragmentación mitocondrial durante la apoptosis. Aunque la microscopía de dispersión óptica normalmente no requiere fluorescencia en este protocolo, se adquirirán imágenes fluorescentes con fines de validación. Tras la configuración del sistema de imagen, las células se marcan con MIT tracker green y se tratan con estreptozotocina para inducir la apoptosis.

Se adquieren datos ópticos para detectar cambios en la orientación de los orgánulos celulares dentro de las dos primeras horas. El inicio de la fragmentación mitocondrial puede medirse mediante los datos de dispersión óptica, que muestran una disminución en el grado de orientación de las partículas subcelulares. Luego, los datos se validan correlacionando los datos de dispersión óptica con las regiones fluorescentes que contienen mitocondrias.

Hola, soy Nada Bustani del Laboratorio de Bioóptica del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad Rutgers. Soy Rob Pak del Laboratorio de Bioóptica, y yo soy Deen, también del Laboratorio de Bioóptica. Hoy les mostraremos un procedimiento para cuantificar la dinámica morfológica subcelular utilizando un método que no depende de colorantes fluorescentes.

Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar los cambios dinámicos en la estructura subcelular durante la apoptosis o muerte celular programada. Así que comencemos. Inicie este procedimiento esterilizando las manos con guantes usando etanol al 70 %.

Luego, coloque una solución stock preparada de 100 nanomolar de miot tracker green y el medio de cultivo de células BAEC precalentado en la cabina con la luz apagada y esterilice todas las superficies. A continuación, coloque una placa de cultivo de seis pocillos con células sembradas sobre cubreobjetos bajo la cabina. Utilizando una pipeta de Pasteur conectada a una línea de vacío.

Retire el medio celular de los pocillos. A continuación, agregue inmediatamente dos mililitros del medio marcado a cada pocillo para marcar las mitocondrias celulares. Tape la placa de cultivo celular para evitar la exposición a la luz directa del ambiente y coloque rápidamente las células de vuelta en el incubador.

Incubar durante 45 minutos a 37 grados Celsius mientras las células incuban. Prepare primero el montaje óptico encendiendo la lámpara de arco de mercurio. Luego encienda las cámaras del microscopio conectadas al ordenador, el láser y conecte el dispositivo digital de microespejos o DMD en el difusor giratorio.

A continuación, observe a través del ocular del microscopio para verificar si la alineación del lanzamiento óptico es correcta. El campo de visión debe estar intensamente iluminado por la luz láser. Para cargar la muestra, coloque una o dos gotas pequeñas de aceite de inmersión sobre un objetivo de inmersión en aceite de 63 x mientras este se encuentra completamente en posición baja.

Luego, coloque en la platina una preparación que consiste en una cuadrícula de líneas a intervalos regulares de 10 micrómetros denominada gradi, y eleve el objetivo de modo que el aceite lo enfoque. A continuación, enfoque el borde hexagonal del diafragma de campo del condensador. Deténgase cuando esté alineado en la iluminación central de Kohler.

El borde hexagonal debe estar centrado en el ocular y enfocado con nitidez. Luego, utilizando los controles de posición del diafragma de campo del condensador, centre el diafragma de campo sobre el campo de visión. Inicie el laboratorio de IP e introduzca los ajustes para operar la cámara.

Confirme que la cámara esté configurada en modo de transferencia de cuadro. Ejecute el comando de adquisición de enfoque para iniciar la vista previa en vivo. Luego, establezca el prefijo de índice y la ubicación del archivo donde se guardarán las imágenes.

A continuación, inicie la imagen RS. Establezca la configuración para operar la cámara cool snap. El modo de sincronización debe ajustarse a normal.

Inicie el software DMD. Coloque el diafragma de campo oscuro en el menú de secuencia de comandos. Luego haga clic en cargar y restablecer.

Para ejecutar el script manualmente, configure la barra óptica del microscopio en la ventana de visualización en modo LSM. Esto enviará la imagen a través del DMD en la óptica alineada. Proyectando la imagen de campo oscuro sobre el CCD de la cámara Cascade Five 12.

La imagen de campo oscuro debe aparecer en la vista previa en vivo en IP lab. Si es necesario, enfoque la imagen en la vista previa en vivo. Ajuste el tiempo de exposición lo suficientemente alto para garantizar al menos 10.000 cuentas de señal en la imagen.

Luego, tome una instantánea del campo de visión utilizando el comando de adquisición única tras la adquisición. Utilice el comando guardar como indexado para guardar la imagen en el disco. La imagen del GTI mide el tamaño del campo de visión.

Ahora mueva la muestra GTI para que quede fuera del campo de visión y solo sea visible el fondo. Capture una imagen de fondo del campo con un tiempo de exposición suficiente para adquirir al menos 5.000 cuentas. Esta imagen ayudará en la sustracción del fondo de las imágenes sin filtrar.

Ahora, para adquirir imágenes filtradas con el filtro de Gabor del fondo, cargue el script del banco de filtros de Gabor al software de control del DMD. Ejecute todo el script para almacenar en búfer los filtros en la memoria integrada del DMD. Esto puede tardar unos minutos una vez que todo el script se haya almacenado en búfer.

Utilice los marcadores de inicio y detención dentro del software DMD para asegurarse de que solo un conjunto de filtros correspondiente a un filtro tipo Gabor se cargue a la vez. Ejecute el script para adquirir imágenes filtradas del fondo. La vista previa de la imagen en vivo debe cambiar de campo oscuro a la imagen filtrada.

Para ese filtro, abra el script de adquisición en IP lab desde el disco. Ajuste el tiempo de exposición para asegurar que se adquieran al menos 2000 cuentas. Mientras el script DMD está en ejecución, cancele la vista previa en vivo en IP lab y ejecute el script de adquisición.

Esto adquirirá automáticamente el índice y guardará la imagen filtrada en el disco. Una vez que se haya adquirido la primera imagen, detenga el script que se está ejecutando en el DMD. Elimine los comandos utilizados del script.

Luego, reemplace los marcadores de inicio y fin al principio y al final del siguiente conjunto de filtros. Repita la adquisición en el laboratorio de IP hasta que se haya utilizado todo el banco de filtros y se hayan adquirido y guardado todas las imágenes filtradas. Prepárese para sembrar las células enchufando un soldador en la mesa de trabajo del laboratorio y calentando el medio L 15 a 37 grados Celsius.

Prepare una estación de trabajo con una toalla de papel y una toalla Kim para absorber cualquier medio derramado y mantener el área limpia. Prepare varios mechas desgarrando y retorciendo toallas Kim. Las mechas se utilizarán para extraer el líquido a través de la placa celular.

A continuación, utilice el portaobjetos metálico para crear un sándwich celular. Use una jeringa para aplicar un fino cordón de grasa al vacío alrededor de la periferia superior del orificio en la placa metálica mecanizada, extendiéndose aproximadamente hasta la mitad de los extremos de las ranuras en cada lado. Pase suavemente un cubreobjetos limpio número uno sobre la grasa.

Dar la vuelta a la placa y aplicar la grasa alrededor del orificio. Apagar las luces del cuarto usando guantes de examen NI esterilizados con etanol. Recuperar las células del incubador.

Retire la cubreobjetos que se utilizará para el experimento de la placa de seis pocillos. Seque cuidadosamente la cubreobjetos. Luego, presione la cubreobjetos con el lado de las células hacia abajo sobre la placa metálica engrasada, cubriendo el orificio de observación.

Colocar las células dentro de la placa. Asegúrese de que no queden espacios de aire y de que la grasa haya formado un sello hermético para que se pueda cargar el medio. Ahora, voltee la placa nuevamente e introduzca 200 microlitros a la vez mediante pipeteo.

Agregue medio L 15 precalentado al sándwich a través del surco entre la cubeta superior y la placa metálica hasta que el líquido casi alcance el surco del otro lado. A continuación, lave las células sosteniendo una mecha en el surco opuesto y pipeteando 200 microlitros adicionales de medio en el sándwich. El medio fluirá de un lado a otro mientras la mecha elimina el medio antiguo.

Tenga cuidado para evitar que se formen burbujas dentro del líquido durante este paso. Repita este proceso dos o tres veces utilizando una mecha nueva para cada enjuague. Ahora invierta la placa una vez más, sosteniéndola por los bordes para atrapar el líquido en el depósito de la celda.

Sumerja la punta del soldador en el vaso de precipitados con veap para derretir rápidamente una pequeña cantidad de veap, que luego se adherirá a la punta del soldador. Con la punta del soldador, aplique cuidadosamente el veap derretido alrededor de los bordes de la lámina de cubierta inferior. Continúe sumergiendo y aplicando a lo largo de todo el perímetro de la lámina de cubierta, sellándola a la placa metálica.

Esto crea un buen sello mecánico para que la cubreobjetos no se desprenda de la placa durante la observación. Limpie cualquier residuo de la parte inferior. Limpie la superficie de la cubreobjetos enrollando una toallita Kim y utilizándola para limpiar la cubierta.

Deslice en un único movimiento continuo para asegurar que la cubreobjetos esté más limpia en el centro, donde será observada. Devuelva la placa de seis pocillos al incubador. Lleve las células sembradas al laboratorio de óptica y colóquelas en el objetivo.

Como antes, busque un campo de células con aspecto saludable y adquiera una imagen en campo oscuro del campo de visión. Luego, alinee el microscopio en contraste de interferencia diferencial (DIC) y asegúrese de que los tiempos de exposición sean adecuados. Adquiera una imagen DIC con una cámara de tipo cascada.

En este montaje, se adquieren imágenes fluorescentes utilizando la cámara cool SNAP mientras el microscopio aún está alineado en DIC. Ajuste el VAR del microscopio a uno x y la ventana de visualización al 100 % binocular, y desvíe la imagen del ocular a la cámara. Coloque un LED azul sobre el condensador para iluminar el campo.

Luego, previsualice el campo de visión en la imagen de RSS y ajuste el enfoque fino. Si es necesario, adquiera una imagen DIC y guárdela en el disco. Observe cómo el campo de visión es diferente del obtenido con la cámara en cascada.

Estas imágenes deberán registrarse durante la fase de análisis del experimento. A continuación, coloque el cubo de filtro fluorescente en posición y adquiera una imagen de fluorescencia activando brevemente la excitación de fluorescencia mediante el obturador del microscopio, y luego desactívelo tan pronto como finalice la adquisición. Para minimizar el fotoblanqueamiento, guarde la imagen de fluorescencia en el disco.

Para obtener imágenes filtradas, restablezca el microscopio al campo y dirija la luz a través del puerto LSM. Como antes, ejecute todo el script del banco de filtros de Gabor como anteriormente para completar la adquisición de datos para un punto temporal mientras las células aún están sobre la platina y sin alterar el campo de visión. Utilice el método de absorción para sustituir el medio L 15 normal por el mismo medio que contiene una solución de un micromolar de STS.

Durante el transcurso del experimento, agregue medio adicional para evitar el secado, pipeteando el medio en la ranura de la placa de células sin retirarla del escenario ni perturbar el campo de visión. Ahora, repita estos pasos para los puntos de tiempo posteriores hasta que el experimento haya finalizado. Los datos recopilados incluirán un gran número de imágenes filtradas que deben procesarse para extraer los datos estructurales subcelulares.

Aquí se muestran dos experimentos de ejemplo. Esta figura muestra imágenes secuenciales de una muestra de alga diatomea marina. Las características orientadas son claramente visibles.

En la imagen en campo oscuro, se muestran las imágenes filtradas ópticamente etiquetadas desde cinco igual a cero grados hasta cinco igual a 160 grados junto con la imagen sin filtrar de la muestra. Para comparación, el conjunto de nueve imágenes filtradas con Gabor de la diatomea se procesó píxel por píxel para determinar la orientación del objeto.

En cada píxel, la señal máxima se dividió por la señal promedio en función de la orientación del filtro para obtener un valor de relación de aspecto. Aquí, una relación de aspecto cercana a uno, indicada por el color azul, está presente en áreas donde no hay un ángulo de respuesta preferido. Valores mayores, indicados por el color rojo, indican áreas donde existe una respuesta a un ángulo preferido más alto.

La luminosidad y el significado del código de la respuesta total del filtro GABOR, así como la orientación del filtro, que proporciona la señal máxima en cada píxel, corresponden a la dirección perpendicular a la orientación del objeto subyacente. La orientación de las partículas de la subestructura se codifica en un gráfico de vectores, donde cada línea concuerda estrechamente con la orientación local del objeto subyacente visible en el campo oscuro sin filtrar. El gráfico de vectores muestra la orientación de los objetos cuyas intensidades de respuesta son superiores al 10 % del valor máximo.

Estas imágenes de campo oscuro y con filtro óptico de un campo contenían células endoteliales bovinas vivas; posteriormente, se adquirieron imágenes filtradas cada 20 minutos durante un período de tres horas tras el tratamiento con el inductor de apoptosis stor sporin. Aquí, el mapa de la relación de aspecto en el panel superior y la imagen de fluorescencia de las mitocondrias en el panel inferior se muestran como función del tiempo. La tonalidad del color representa el grado de orientación; al igual que antes, estas gráficas temporales comparan la disminución del grado de orientación de la relación de aspecto de las partículas en células endoteliales tratadas con s thoro sporin, y cada trazo individual representa gráficas temporales dentro de células individuales.

La orientación de las gotas se limita a las regiones de las células que coinciden con las regiones fluorescentes. Ahora se ha logrado la validación frente a la fluorescencia. Se convierte en archivada.

Por lo tanto, en los próximos experimentos, las mediciones mitocondriales pueden realizarse omitiendo los pasos de imagen de fluorescencia y utilizando directamente el método de dispersión óptica. Acabamos de mostrarle cómo monitorear la fragmentación mitocondrial durante la apoptosis mediante firmas de dispersión de luz basadas en filtros de Gabor. Al realizar este procedimiento, es importante tener una buena preparación previa y asegurarse de que el montaje óptico esté bien alineado y calibrado.

Entonces, tomemos sentido para observar y colaborar con experimentos de interfaz de usuario.