MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina
29 de abril de 2007
Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).
Bienvenido al tutorial del laboratorio CHI sobre el método de capa ultradelgada, que es particularmente útil para la determinación precisa de la masa de proteínas. Debido a la naturaleza sensible de la espectrometría de masas, solo utilizamos reactivos de grado HPLC, así como guantes de látex o nitrilo sin polvo para limpiar la placa. Enjuague alternativamente con metanol, agua y, finalmente, metanol nuevamente.
Entre cada enjuague, limpie suavemente el exceso de disolvente utilizando papel para lentes. Puede repetir estos pasos de lavado tantas veces como sea necesario para obtener una placa limpia. Y una vez limpia y seca, la placa debe usarse inmediatamente.
Aplique y extienda de 20 a 30 microlitros de solución de sustrato en capa delgada sobre la placa MALDI limpia. Aquí utilizamos una punta de pipeta P2-50 para extender uniformemente la solución, evitando rayar la placa. A medida que la capa delgada se seca, elimine cualquier gota de agua residual presente mediante absorción suave con una toallita kim.
Luego, limpie suavemente la placa con un movimiento uniforme utilizando una toalla Kim para formar adecuadamente la capa delgada. Finalmente, limpie los bordes de la placa para evitar contaminar el espectrómetro de masas. Es fundamental probar la capa delgada antes de aplicar su muestra.
Si la mancha de prueba tarda demasiado en secarse y los cristales no son homogéneos, el problema podría estar en la capa delgada misma o en la solución de matriz; limpie la placa, vuelva a aplicar la capa delgada y realice nuevamente la prueba. Al aplicar las muestras sobre la capa delgada, no desea que sus manchas se evaporen hasta secarse. Más bien, una vez que la cristalización haya disminuido y se haya detenido, retire el exceso de disolvente.
Mediante un aspirador de vacío, la presencia de contaminantes como sales y detergentes, así como una alta concentración de analito, puede interferir con la cristalización. Una mayor dilución de la muestra podría mejorar la cristalización. Ubique las manchas de calibración cercanas a la muestra. Esto permitirá una calibración pseudo-interna en la que la placa se mueve desde la mancha de la muestra hasta la mancha de calibración.
Durante la adquisición de la muestra, al agregar algunos disparos láser del CAS al espectro, este enfoque garantiza una calibración con mayor precisión de masa que la calibración externa por sí sola. Es muy importante eliminar mediante lavado cualquier contaminante, como sal o detergente, que pueda interferir con la ionización del analito. Para ello, deposite directamente sobre los puntos agua helada, fría, con 0,1 % de ácido trifluoracético en agua de grado HPLC.
Retire la solución de lavado utilizando un aspirador al vacío como se muestra aquí. Este método produce espectros excelentes tanto para proteínas de membrana como solubles.
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Resumen
Este video demuestra la preparación de una capa ultrafina de matriz/analito para analizar péptidos y proteínas mediante espectrometría de masas con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-MS). El método es esencial para la determinación precisa de la masa de proteínas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Espectrometría de masas
- Análisis de proteínas
- Química analítica
Antecedentes
- La espectrometría de masas es una técnica sensible para analizar biomoléculas.
- La preparación de la placa de muestra es crucial para obtener resultados precisos.
- Se recomiendan reactivos de grado HPLC para la limpieza.
- Las técnicas adecuadas de manipulación y limpieza mejoran la calidad del análisis.
Objetivo del estudio
- Demostrar el método de la capa ultradelgada para la espectrometría de masas MALDI.
- Asegurar la determinación precisa de la masa de proteínas.
- Proporcionar un tutorial sobre las mejores prácticas para la preparación de muestras.
Métodos Utilizados
- Uso de reactivos de grado HPLC.
- Limpieza de la placa con metanol y agua.
- Eliminación del exceso de disolvente con papel para lentes.
- Uso inmediato de la placa limpia para el análisis.
Resultados principales
- Mostró métodos eficaces de limpieza para la placa de muestra.
- Destacó la importancia de usar materiales adecuados.
- Mostró los pasos de preparación para una capa ultrafina.
- Proporcionó información sobre el mantenimiento de la integridad de la muestra.
Conclusiones
- El método de capa ultrafina es fundamental para una espectrometría de masas precisa.
- Las técnicas adecuadas de limpieza y preparación son esenciales.
- Seguir las mejores prácticas puede mejorar significativamente los resultados del análisis.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La determinación precisa de la masa de proteínas es fundamental para la validación de objetivos y la identificación de compuestos iniciales en las primeras etapas del descubrimiento. El método de preparación de muestras MALDI con capa ultrafina mejora la calidad de los datos al aumentar la tolerancia a impurezas y la uniformidad espacial, lo que favorece una evaluación confiable de los compuestos. Este método permite una confianza predictiva en la caracterización de proteínas, reduciendo la ambigüedad mecanicista en la selección de modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la determinación precisa de la masa de proteínas, lo que apoya la verificación de hipótesis terapéuticas y la validación funcional de objetivos.
- Valor operativo: Proporciona mayor tolerancia a sales y detergentes, reduciendo los falsos negativos en muestras propensas a impurezas.
- Valor predictivo: Mejora la resolución y la uniformidad espacial, aumentando la confianza en la identidad de las proteínas y su estado de modificación.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Produce espectros de alta calidad y reproducibles, esenciales para la estandarización de ensayos y la consistencia en las lecturas cuantitativas.
- Valor operativo: Utiliza pasos sencillos y robustos compatibles con entornos de cribado de alto rendimiento.
- Escalabilidad: Permite la preparación de placas de muestras validadas para flujos de trabajo posteriores, favoreciendo la reutilización de la plataforma en distintos proyectos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Permite el análisis de proteínas tanto de membrana como solubles, posibilitando la caracterización de sistemas relevantes para enfermedades.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Facilita la determinación precisa de la masa de proteínas con amplios rangos de masa (hasta 380 kDa), lo que ayuda en la optimización del fármaco líder.
- Alineación con Modelos Preclínicos: Aplicable a canales iónicos, transportadores y receptores, apoyando la validación de dianas en modelos fisiológicamente relevantes.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de capa ultradelgada se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación temprana del blanco hasta la identificación de compuestos activos y el perfilado preclínico, permitiendo un análisis de proteínas confiable en cada etapa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis al proporcionar datos de masa precisa para la identificación y caracterización de proteínas.
- Selección: Ofrece resultados cuantitativos reproducibles que permiten una evaluación confiable de compuestos en el desarrollo de ensayos.
- Análisis: Genera espectros de masas de alta resolución con uniformidad espacial, mejorando la comparabilidad de los datos entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la continuidad preclínica mediante el análisis consistente de masas proteicas en distintos tipos de muestras.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad estandarizada y robusta de preparación de muestras aplicable a múltiples clases de proteínas y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la determinación de la masa proteica, reducción de la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y tolerancia a contaminantes comunes como sales y detergentes.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción mediante una calidad de datos mejorada, reduciendo el riesgo biológico en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo basada en datos fiables de caracterización proteica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de muestras para espectrometría de masas y en los principios de la MS con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-MS).
- Necesita acceso a reactivos de grado HPLC, aspirador de vacío y placas compatibles con MALDI.
- Exige procedimientos estandarizados de limpieza y secado para garantizar la uniformidad de la capa.
- Requiere adaptación según las concentraciones variables de analitos y las matrices de las muestras.
- Limitado por la necesidad de usar las placas inmediatamente después de la limpieza para evitar recontaminación.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
2:05
Step 5: test of the thin layer
2:50
Step 6: sample application
3:47
Step 7: calibrant application
1:52
Step 4: preparation of the matrix solution
0:58
Step 3: making the thin layer substrate
0:20
Step 1: cleaning of the sample plate
4:20
Step 8: washing step
0:46
Step 2: preparation of the thin layer substrate solution
5:05
Step 9: acquisition of mass spectra
