Vídeo Bioinformática Análisis de Crecimiento Humano Colonia células madre embrionarias

Este protocolo demuestra un método de bioinformática de video para medir el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas mediante el análisis de videos de lapso de tiempo recopilados en un incubador CT de la estación bio iCon, equipado con una cámara para imágenes de video. Las colonias de células madre embrionarias humanas, o colonias de HESC, se cultivan hasta alcanzar una confluencia del 70 %, se replantean y se incuban durante 48 horas, tras lo cual se filman las colonias de HESC durante 48 horas adicionales en el Biot ct. La tasa de crecimiento se determina utilizando recetas de mejora de segmentación y mediciones desarrolladas con el software CL-quant.

Las recetas se validan mediante comparación con Adobe Photoshop, una herramienta de análisis de imágenes que permite ajustar manualmente máscaras precisas a cada colonia. El campo emergente de la bioinformática de video puede utilizarse para automatizar el procesamiento, análisis y minería de datos biológicos a partir de videos microscópicos. Hola, soy Serena Lin del laboratorio del Dr. Prue Talbot en el Departamento de Biología Celular y Neurociencia de la Universidad de California en Riverside.

Hola, soy Sean Fino, también del Laboratorio Talbot. Hola, soy TI Satish del Programa de Posgrado en Biología Celular, Molecular y del Desarrollo. Hoy les mostraremos cómo medir el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas utilizando herramientas de bioinformática de video.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para medir los efectos de los tóxicos ambientales sobre el comportamiento de las células madre embrionarias humanas. Vamos a demostrar este procedimiento en nuestra nueva instalación central de células madre. Así que comencemos.

Para preparar las CESH para el análisis de video, cultive las CESH en placas de seis pocillos recubiertas con Matrigel hasta alcanzar una confluencia del 70 %. Aspire el medio de un pocillo que contenga CESH y enjuague dos veces con un mililitro de PBS. Añada un mililitro de Accutase e incube durante un minuto a 37 grados Celsius en 5 % de dióxido de carbono. A continuación, agregue de 10 a 12 perlas de vidrio al pocillo y agite suavemente la placa hasta que las colonias se desprendan completamente.

Neutralice el Accutane utilizando un mililitro de medio de mantenimiento de células madre embrionarias humanas o medio acondicionado de fibroblastos embrionarios de ratón. Recopile las células desprendidas sin las perlas en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue a 200 G durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda el botón celular con 500 microlitros de medio fresco de mantenimiento de células madre embrionarias humanas o M-T-E-S-R. Inocule 100 microlitros de la suspensión de HESC gota a gota en múltiples pocillos de una placa de 12 pocillos recubierta con matrigel.

Mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y observe los cultivos bajo un microscopio de luz para asegurarse de que los agregados celulares estén distribuidos uniformemente en todos los pocillos. Coloque la placa en un incubador a 37 grados y 5% de dióxido de carbono durante 48 horas para garantizar que las células se adhieran planas y alcancen un tamaño suficientemente grande para visualizarlas fácilmente. Después de 48 horas, aspire el medio y lave los pocillos con 500 microlitros de PBS para eliminar las células no adheridas, luego agregue 500 microlitros de medio M-T-E-S-R a cada uno.

Coloque inmediatamente la placa en el Biot CT y comience a recopilar imágenes de lapso de tiempo. Intente seleccionar campos con colonias individuales bien definidas que no tengan probabilidades de crecer hacia otras colonias. En este protocolo, las células se graban en video durante 48 horas adicionales con cuadros a intervalos de siete minutos.

Para crear la receta de segmentación, primero examine manualmente todo el video para verificar que contiene una sola colonia que permanece enfocada durante todo el período de grabación. Después de esto, abra el asistente de segmentación en el software CL quants y haga clic en el botón siguiente. Seleccione el canal de imagen correcto y haga clic en el botón siguiente.

Seleccione coincidencia suave y haga clic en Siguiente. Elija una o dos regiones deseadas rodeando con un círculo el borde exterior hasta el área central de la colonia. Esta área debe ser lo más pequeña posible, pero debe ser representativa de toda la colonia.

No seleccione demasiadas regiones, ya que esto podría provocar una aplicación inexacta de la máscara. Haga clic en el botón siguiente. Seleccione las regiones que no desea rodeando aquellas que no forman parte de la colonia ni del fondo.

Estas regiones presentan patrones que deben suprimirse, como escombros y células muertas. Haga clic en siguiente. Seleccione el fondo rodeando con un círculo las regiones que no son colonias, escombros ni células muertas.

El fondo debe ser uniforme y probable que aparezca en cada cuadro. Normalmente, seleccionamos el fondo gris alrededor de la colonia. Haga clic en el botón siguiente.

Debe mostrarse una máscara de color sobre la región de interés si la máscara no cubre de forma precisa dicha región. El rango de umbral de segmentación situado en la esquina inferior derecha de la pantalla puede aumentarse o disminuirse si es necesario modificar la máscara. Seleccione actualizar las regiones de coincidencia suave.

Esto permite cambiar las áreas deseadas, no deseadas o de fondo. Si la máscara es satisfactoria, seleccione aplicar umbral y guarde mi máscara. Luego haga clic en el botón siguiente.

La máscara se mostrará entonces en un color diferente. Seleccione finalizar. La receta debe aparecer en la esquina superior derecha del software como receta de segmentación.

Cambie el nombre de la receta si lo desea haciendo clic derecho e ingresando un nuevo nombre. Para aplicar la receta, haga clic derecho y coloque el ratón encima.

Aplique la receta. Aparecerá un menú que permitirá seleccionar el número de fotogramas a utilizar. Establezca el intervalo de fotogramas cada 20 fotogramas para asegurar la fidelidad de la máscara.

Revise manualmente al azar el 10% de los fotogramas a los que se aplicó la máscara para crear una receta de mejora que elimine regiones no deseadas en los residuos. Haga clic con el botón derecho en la carpeta de la receta de mejora y luego haga clic en nuevo. Debe mostrarse una nueva receta de mejora a partir del campo original de visión.

Mueva el cursor del ratón sobre los iconos de la barra de herramientas para identificar el botón del módulo de mejora de alternancia ubicado a la derecha de la imagen y haga clic en él. Seleccione el menú desplegable de etiquetado. Seleccione etiquetado para conexión dos conectada.

Debería mostrarse una nueva barra de tareas. Tome la máscara inicial de la receta de segmentación y arrástrela al cuadro de entrada. La barra ahora debe mostrar el número de la máscara de entrada.

Arrastre el icono con el número de máscara de entrada al icono de máscara cero. Busque el tamaño mínimo en la barra de tareas y ajuste el número hasta que solo se muestre la región de interés. Asegúrese de hacer clic en ejecutar para cada intento de ajuste.

Una vez que el ajuste del tamaño mínimo sea satisfactorio, haga clic en la receta de mejora anterior en la parte inferior de la pantalla y seleccione guardar en receta. El software ahora solicitará sobrescribir la receta seleccionada; seleccione sí en el punto. Verifique la receta de mejora utilizando el mismo procedimiento que el utilizado para verificar el segmento.

Si está satisfecho con las recetas de segmentación y mejora, continúe para crear la plantilla de medición. Para comenzar, seleccione crear plantilla de medición en la barra de herramientas derecha. En la ventana de medición, seleccione mover el cursor sobre la figura de la célula del clip art.

Mantenga presionada la tecla de control y seleccione la celda bajo la sección de morfología, desactive el parámetro predeterminado y active el parámetro de área. Luego, salga de la ventana de plantilla. Seleccione el icono.

Cree una receta de medición. Cambie el nombre de la receta. Vaya a la pestaña de plantilla y selecciónela. En la esquina superior derecha, arrastre y suelte la plantilla de medición creada previamente sobre la ventana de medición.

Haga clic en sí para continuar en la ventana de receta de medición, seleccione las asignaciones de canales. Luego seleccione las asignaciones de máscara de célula completa. A continuación, seleccione la opción de célula completa. Para la máscara mejorada, seleccione la receta de medición en la pestaña de recetas.

En la ventana principal, seleccione el icono de guardar dentro de la ventana de la receta de medición. Luego cierre la ventana. A continuación, cierre y vuelva a abrir el campo de visión. Haga clic con el botón derecho en la carpeta de la lista de recetas y luego haga clic en nueva, arrastre las recetas en el orden necesario para la aplicación a la lista de recetas, seleccione bloquear lista de recetas y ejecute las recetas secuencialmente sobre los datos de video utilizando Adobe Photoshop.

Se analizó cada marco número 20 de las mismas colonias. Abra manualmente un marco de una imagen de colonia en Adobe Photoshop. Haga clic en la herramienta de varita mágica en la barra de herramientas.

Haga clic en el área alrededor de la colonia para que todo el campo quede cubierto, excepto la región de la colonia. Asegúrese de que la línea punteada alrededor de la colonia siga exactamente el perímetro de la colonia y no esté dentro de ella. Si la línea punteada no rodea el perímetro, cambie el valor de tolerancia en la barra de herramientas superior según sea necesario.

Haga clic en editar en el modo de máscara rápida en la barra de herramientas y haga clic en la colonia para seleccionarla. Vaya a la ventana, despliegue el menú y haga clic en histograma. La caché debe establecerse en uno.

Si la caché es dos, haga clic en el signo de expresión de exclamación para cambiar la caché a uno. Registre el valor del píxel en una hoja de cálculo. Repita el proceso anterior para cada cuadro número 20.

Los datos recopilados utilizando Photoshop y el software CL quant pueden luego representarse conjuntamente. Nuestro protocolo para cuantificar el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas demuestra una aplicación de la bioinformática de video a un problema biológico. Aquí mostramos un gráfico que compara el aumento del tamaño de la colonia durante 48 horas, determinado mediante el software CL quant y Adobe Photoshop.

El gráfico muestra cinco colonias diferentes, cada una analizada por ambos paquetes de software. Cada colonia está representada por un color diferente. Las líneas continuas se obtuvieron utilizando el software sail quant, mientras que las líneas punteadas se obtuvieron utilizando Photoshop.

El gráfico de los datos brutos muestra que ambos métodos de medición están en buen acuerdo al considerar el hecho de que las colonias tienen un tamaño inicial diferente. Esta figura muestra los datos nuevamente representados como el porcentaje de aumento en el tamaño de la colonia. Las tasas de crecimiento son similares independientemente del tamaño inicial de la colonia, y ambas medidas de análisis arrojan resultados semejantes.

El siguiente gráfico muestra las medias de los datos anteriores de cambio porcentual en el crecimiento de colonias de CESH. Este gráfico muestra claramente una buena concordancia entre el análisis realizado utilizando bioinformática de video y Adobe Photoshop. Acabamos de mostrarle cómo medir el crecimiento de colonias de células madre embrionarias humanas utilizando herramientas de bioinformática de video.

Al realizar este procedimiento utilizando microscopía de contraste de fases, asegúrese de incluir el halo alrededor de la colonia para una selección precisa de colonias por parte del software. También es importante recordar que pueden utilizarse otros métodos para el cultivo, la incubación y la recopilación de videos en lugar del protocolo que demostramos. Una vez desarrolladas y validadas las recetas, realizarán el análisis mucho más rápidamente y con menos variación experimental que el análisis manual.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.