Ensayo experimental de metástasis

El objetivo general del siguiente experimento consiste en evaluar las capacidades metastásicas de células cancerosas humanas mediante inyecciones en la vena caudal. En ratones inmunodeficientes, las células se preparan para la inyección. A continuación, las células se inyectan en ratones inmunodeficientes, los cuales desarrollarán metástasis pulmonares tras uno o dos meses.

Se disecan los ratones y se cuantifican y cultivan las metástasis pulmonares. Los resultados de este tipo de ensayo indican el grado de metástasis de un tipo particular de célula cancerosa. Hola, soy Sonali Mohanty del laboratorio del Dr. LE en el Departamento de Genética Biomédica de la Universidad de Rochester.

Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar un ensayo de metástasis experimental. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la metástasis del cáncer. Así que comencemos.

Comience con células cultivadas hasta aproximadamente el 70 % de confluencia. Aspire el medio del pocillo y lave suavemente una vez con un XPBS. A continuación, agregue dos mililitros de tripsina al 0,05 % invirtiendo. Mueva suavemente el pocillo para facilitar la disociación celular.

Observe las células bajo un microscopio mientras se desprenden. Añada un volumen abundante de medio que contenga suero bovino fetal (FBS) para detener la actividad de la tripsina. Luego, transfiera a un tubo de 50 mililitros.

Cuente las células utilizando un hemocitómetro. Una vez determinada la concentración, centrifugue a aproximadamente 200 veces la gravedad durante tres minutos sin perturbar el pellet celular. Retire cuidadosamente el medio y resuspenda en un volumen adecuado de solución tampón de Hank equilibrada o HBSS para alcanzar una concentración final de aproximadamente cinco por 10 a la seis células por mililitro.

A continuación, filtre a través de un filtro celular de 70 micrómetros de Falcon. Para excluir agregados celulares grandes, coloque la punta de la pipeta directamente sobre el filtro, colocado encima de un tubo de cultivo de cinco mililitros. Eyecte rápidamente la suspensión a través del filtro hacia el tubo.

Cuente nuevamente las células utilizando azul de tripano para determinar la viabilidad. La viabilidad debe ser mayor al 90 % antes de la inyección. Luego, diluya hasta una concentración final de 2,5 × 10⁶ células por mililitro.

Mantenga en hielo. Tome suavemente la cola de un ratón inmunodeficiente y sáquela hacia el sujetador de ratón con su espalda contra la ranura y su cola saliendo por la abertura pequeña en la parte trasera. Deslice lentamente el anillo hacia adentro a lo largo de la ranura.

Una vez que el anillo capture la boca del ratón, bloquéelo en su lugar. El ratón no debería poder moverse libremente, pero debe mantener una frecuencia respiratoria normal. Localice las venas principales de la cola.

Hay cuatro vasos sanguíneos principales en la cola de un ratón. Las arterias se encuentran en los lados dorsal y ventral de la cola. Las venas se ubican en los lados laterales.

Aspire al menos 200 microlitros de las células preparadas en una jeringa de un mililitro. Coloque una aguja de calibre 30 y media y expulse cualquier burbuja de aire. El volumen final en la jeringa debe ser de 200 microlitros.

Prepárese para inyectar en el extremo distal de la cola. Así, si el primer intento falla, se puede utilizar una región más proximal de la cola para un segundo intento. Después de limpiar el sitio de inyección con etanol al 70 %, tire suavemente de la cola para enderezarla.

Sostenga la punta con el pulgar y apoye la punta para la inyección con el dedo índice. Introduzca la aguja en la vena e inyecte las células. Asegúrese de que la aguja y la jeringa estén paralelas a la vena durante la inyección.

De lo contrario, la aguja atravesará la pared del vaso y las células se inyectarán en los tejidos adyacentes de la cola. Retire la aguja si el procedimiento fue exitoso. La sangre debe perfundirse desde el sitio de inyección.

Presione una bola de algodón limpia para facilitar el uso del hilo dental y palpe la cola hacia arriba para impulsar cualquier muestra residual hacia la circulación. Suelte al ratón del sujetador y devuélvalo a la jaula. Registre el número de intentos de inyección y el número de células inyectadas en un cuaderno de laboratorio.

Determine la viabilidad de las células después de la inyección. Como antes, este paso proporciona la seguridad de que las células permanecen vivas durante todo el proceso de inyección. Al final de un experimento de inyección, la viabilidad de las células disminuirá, pero debe mantenerse por encima del 80 %. Como paso opcional, centrifugue las células sobrantes y lave los sedimentos con PBS una vez.

Luego, congele los pellet a menos 80 grados Celsius para análisis futuros, como el inmunotransferencia. Para confirmar la expresión génica tras el silenciamiento, después de uno a dos meses, diseccione los ratones para determinar las ubicaciones de las metástasis. Comience colocando el ratón sacrificado en una estación de disección.

Rocíe al ratón abundantemente con etanol. Corte la caja torácica para exponer los pulmones y el corazón. Luego, extirpe con cuidado estos órganos y colóquelos en PBS.

El pulmón es el sitio primario de metástasis ya que contiene la primera cama capilar que encuentran las células. Después de que ingresan a la circulación, retire el corazón y lave los pulmones en PBS, luego observe cada lóbulo del pulmón bajo un microscopio estereoscópico. Cuente el número de metástasis detectables en ambos lados del pulmón y luego sume el número de metástasis pulmonares en los cuatro lóbulos para determinar el número total de metástasis pulmonares.

A continuación, aísle metástasis pulmonares individuales mediante escisión usando tijeras. Transfiera cada metástasis a un filtro celular de 70 micrómetros y tritúrelo usando el extremo de una tapa estéril de aguja. Enjuague el filtro celular con varios mililitros de medio y recoja las células que pasan a través del filtro.

En un plato de cultivo, cada plato contiene células de una metástasis. Incubar las células a 37 grados Celsius durante al menos cuatro días sin perturbarlas. Inicialmente, tanto las células cancerosas como las células fibroblásticas crecerán en las placas, pero gradualmente las células fibroblásticas morirán y serán reemplazadas por células cancerosas.

Si las células cancerosas portan genes resistentes a fármacos, seleccione las células con los antibióticos correspondientes. Después de tres días, lave con PBS cualquier sangre o restos de tejido, restos en el recipiente, y agregue medio fresco. Evalúe la pureza de las células derivadas mediante tinción inmunológica con anticuerpos contra proteínas específicas humanas aquí; se utiliza un anticuerpo anti-humano incluso en ausencia de selección con fármacos. Más del 99 % de las células deben ser humanas.

Las células recién obtenidas ahora pueden volver a inyectarse en ratones inmunodeficientes para evaluar sus capacidades metastásicas al final de este ensayo. Una línea celular de cáncer altamente metastásica generalmente produce muchas metástasis pulmonares, mientras que muy pocas metástasis pulmonares provendrán de una línea celular de cáncer pobremente metastásica. Estas imágenes muestran metástasis pulmonares dos meses después de la inyección de la línea celular de melanoma humano.

Un 3 7 5 sm. Las células derivadas mediante este método suelen producir más metástasis que la línea parental cuando se prueban. Nuevamente utilizando este ensayo, acabamos de mostrarle el procedimiento para realizar un ensayo de metástasis experimental.

Al realizar este procedimiento, es muy importante recordar asegurarse de que las células se inyecten en la vena de la cola, pero no en el tejido de la cola ni en su interior. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.