La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos
19 de mayo de 2010
Se describe una molécula basada en pequeñas protocolo para la diferenciación de las células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC). Este protocolo genera Olig2 + NG2 + OPC con alta eficiencia de 30 días de diferenciación. También describe un método para generar "picos" OPC que puede disparar potenciales de acción.
El objetivo general del siguiente experimento consiste en generar precursores de oligodendrocitos a partir de células madre embrionarias mediante una serie de pasos de cultivo durante 30 días. Esto se logra primero generando cuerpos embrionarios a partir de células ES de ratón para iniciar la diferenciación celular. Como segundo paso, los cuerpos embrionarios se tratan con las moléculas pequeñas ácido retinoico y morfina pura, que inducen la diferenciación dirigida de las células hacia un liga den.
Precusores celulares. Como tercer paso, los cuerpos embrionarios se disgregan en células individuales tras otros 22 días. En cultivo, aproximadamente el 80 % de las células son OPC.
A continuación, los OPC derivados de MESC se transducen con virus bao que portan la subunidad NAV 1.2 para generar OPC que presentan actividad de disparo. Los resultados obtenidos muestran la expresión del marcador de OPC y las propiedades de disparo de estos OPC derivados de MESC, basados en microscopía de inmunofluorescencia y grabaciones electrofisiológicas. Hola, soy Pong Chiang del laboratorio del Dr. Ing en el Departamento de Biología Celular y Anatomía Humana de la Universidad de California en Davis. También estamos afiliados al Hospital Shriners para Niños del Norte de California.
Hola, soy Vial Raj, también del laboratorio Deng. Hoy les mostraremos un procedimiento para la diferenciación de células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar las propiedades de los precursores de oligodendrocitos derivados de células madre embrionarias, con el fin de generar células con un mayor potencial terapéutico.
Así que comencemos. Hoy, las células precursoras de oligodendrocitos o COP se generarán a partir de la línea de células madre embrionarias OG dos GFP de ratón. Estas células madre embrionarias deben pasarse cada tres días para mantenerlas sanas a una densidad óptima y prevenir la diferenciación espontánea. Pase.
Las células ESS cuando están al 70 % de confluencia bajo una campana de flujo laminar. Retire el medio sobre el cultivo. Lave con PBS y los ojos de tripsina con dos mililitros de precalentamiento.
Un ciclo de LE express a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Detenga la reacción y resuspenda las células en cuatro mililitros de medio celular MES. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y forme el pellet a 1000 RP durante cinco minutos.
Re-suspender en medio de placa MESL, una décima parte de las células sobre una capa confluyente de alimentadores de metotrexato irradiados en medio para células MES. Después de tres días, las células ES tienen aproximadamente un 70 % de confluencia y están listas para ser pasadas o suspendidas para formar cuerpos embrionarios e inducir la diferenciación. Digiere las colonias de células ES de ratón como antes y luego re-suspende las células en medio con reemplazo de suero knockout o medio KSR. Cuenta las células en un hemocitómetro y diluye la suspensión en KSR.
Medio a 15.000 células por mililitro, plate tres mililitros en cada pocillo de una placa de cultivo ultrabaja de seis pocillos. Incube las células en suspensión a 37 grados Celsius durante cuatro días. Cambie completamente el medio cada dos días.
A partir del cuarto día, reemplace el medio diariamente el cuarto día. Suplemente el KSR con 0,2 micromolar de ácido retinoico el quinto día y con ambos, ácido retinoico y un micromolar de primor famine, los días sexto y séptimo. Alimente los cuerpos embrionarios con dos medios, suplementados con 0,2 micromolar de ácido retinoico y un micromolar de primor famine. Después de ocho días en cultivo, la mayoría de los cuerpos embrionarios expresan GFP y están listos para ser disgregados con tripsina, y se deben contar las células como antes.
Luego, resuspenda las células a 3,5 × 10⁵ células por mililitro. En medio OPC, reconstituya tres mililitros de la suspensión en medio OPC. Utilizando placas de 60 milímetros recubiertas con poliornitina, aproximadamente cada semana las células alcanzarán confluencia y tendrán este aspecto. Pase las células como antes, con una tripsinización de tres minutos.
30 días después de la suspensión inicial de resus. En medio KSR, las células muestran características de células precursoras de oligodendrocitos para generar OPCs que disparan potenciales de acción. Utilice OPCs derivadas de ESL de ratón que estén entre un 50 y un 70 % confluentes.
Cambie el medio por un XPBS para enjuagar las células. Para introducir el canal de sodio activado por voltaje, subunidad alfa 1.2.
Utilizamos el kit del canal de sodio back MAM. Mezcle un mililitro del componente A de back MAM con cuatro mililitros de 1 XPBS. Elimine la enjuague con PBS y agregue el componente diluido.
Incubar a 37 grados Celsius durante dos horas. Reemplace el agente de memoria posterior con medio OPC enriquecido con los componentes B y C, como se describe en el kit. Incubar durante dos horas adicionales a 37 grados Celsius.
Después de la incubación, reemplace el medio enriquecido por medio OPC fresco. Después de otras 24 horas de cultivo, los OPC derivados de ESL pueden ser analizados para evaluar la actividad de disparo en este punto temporal. Los EBS no muestran ninguna fluorescencia GFP.
Los EBS muestran una fuerte expresión de GFP y están listos para el cultivo por disagregación durante unos 30 días después de la suspensión inicial de resus. En medio KSR, la mayoría de las células son inmuno positivas para la tinción de NG dos, lo que es consistente con la expresión de GFP. Sin embargo, a diferencia de los OPC del cerebro, estos OPC derivados de células MES no generan potenciales de acción incluso cuando las células se despolarizan hasta cero milivoltios.
Después de introducir el subunidad NAV 1.2 mediante transducción viral, estos OPC derivados de células MES se excitan y generan potenciales de acción. Acabamos de mostrarle cómo diferenciar células madre embrionarias de ratón en OPC y generar OPC que disparan potenciales mediante transducción viral. Al realizar este procedimiento, es importante recordar almacenar adecuadamente el ácido retinoico, el morfina y el FGF dos, y utilizar siempre alícuotas frescas; deseche cualquier exceso de ácido retinoico después de su uso.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
Resumen
Este artículo presenta un protocolo para diferenciar células madre embrionarias de ratón en células precursoras de oligodendrocitos (OPC) utilizando moléculas pequeñas. El método logra una alta eficiencia en la generación de OPC Olig2+NG2+ en 30 días e incluye una técnica para producir OPC que disparan potenciales de acción.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación con células madre
Antecedentes
- Las células precursoras de oligodendrocitos (OPC) son cruciales para la mielinización en el sistema nervioso central.
- Las células madre embrionarias de ratón (células ES) pueden diferenciarse en OPC para fines de investigación y terapéuticos.
- Las moléculas pequeñas pueden dirigir eficazmente el proceso de diferenciación.
- Comprender las propiedades de las OPC puede mejorar el potencial terapéutico en trastornos neurológicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo confiable para generar células precursoras de oligodendrocitos (OPC) a partir de células ES de ratón.
- Investigar las propiedades electrofisiológicas de las OPC diferenciadas.
- Explorar el potencial de las OPC con actividad de disparo en aplicaciones terapéuticas.
Métodos Utilizados
- Se forman cuerpos embrionarios a partir de células ES de ratón para iniciar la diferenciación.
- Se utilizan moléculas pequeñas, incluyendo ácido retinoico y morfina pura, para inducir la diferenciación.
- Las células se disgregan y se cultivan para enriquecer las OPC.
- Se emplea la transducción viral para introducir canales de sodio activados por voltaje en las OPC.
Resultados principales
- Alrededor del 80 % de las células cultivadas se identifican como OPC después de 30 días.
- La microscopía de inmunofluorescencia confirma la expresión de marcadores de OPC.
- Los registros electrofisiológicos demuestran las propiedades de generación de potenciales de acción en las OPC transducidas.
- Las OPC no transducidas no exhiben potenciales de acción, lo que resalta la eficacia del método de transducción viral.
Conclusiones
- El protocolo genera eficazmente OPC a partir de células madre embrionarias de ratón.
- La transducción viral convierte con éxito a las OPC en células que generan potenciales de acción.
- Este método proporciona una base para estudiar las OPC en el contexto de la investigación y terapia neurológicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La diferenciación eficiente de células madre embrionarias en células precursoras de oligodendrocitos (OPC) responde a una necesidad crítica de fuentes celulares escalables y comprometidas con la línea celular en la investigación regenerativa del SNC. Este protocolo permite la generación de alto rendimiento de OPC con fenotipo definido, lo que favorece la confianza predictiva en la validación temprana de dianas y en estudios funcionales. El enfoque facilita la reducción de riesgos mecanicistas y la selección de carteras para estrategias terapéuticas basadas en células dirigidas a enfermedades desmielinizantes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar el compromiso de la línea oligodendrocítica y la especificidad de las vías mediante marcadores moleculares definidos.
- Apoya la desactivación de riesgos biológicos mediante la generación de OPC con perfiles de expresión consistentes de Olig2 y NG2.
- Facilita la confianza predictiva en la validación funcional de dianas a través de la caracterización electrofisiológica de subpoblaciones de OPC.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Proporciona una fuente reproducible de OPCs validadas para cribado de compuestos y ensayos fenotípicos posteriores.
- Normaliza los productos de diferenciación, asegurando el desarrollo cuantitativo y escalable de ensayos.
- Permite la evaluación confiable de moléculas candidatas en sistemas de linaje de oligodendrocitos relevantes para la enfermedad.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea los modelos de OPC in vitro con los fenotipos derivados de tejido primario para lograr una continuidad traslacional.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir estudios funcionales sobre OPCs con actividad de disparo y sin actividad de disparo.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos para candidatos en la línea de terapia celular dirigidos a la desmielinización.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de diferenciación se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, permitiendo la validación temprana de objetivos, el desarrollo de ensayos y la investigación traslacional sobre la biología de las OPC.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre el compromiso de linaje y las propiedades funcionales de las OPC.
- Cribado Proporciona poblaciones estandarizadas y reproducibles de OPC para plataformas de ensayos cuantitativos.
- Análisis: Proporciona lecturas de inmunofluorescencia y electrofisiología para el análisis comparativo de subtipos de OPC.
- Investigación traslacional Vincula hallazgos in vitro con modelos de tejido primario para la alineación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo reutilizable para la generación de OPCs en múltiples programas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación centrada en OPC.
- Valor operativo: Proporciona una generación estandarizada, escalable y reproducible de OPC para flujos de trabajo entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital en carteras de terapia celular y neuroregeneración.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos basados en OPC.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo de células madre, diferenciación y transducción viral.
- Exige acceso a infraestructura de microscopía de inmunofluorescencia y grabación electrofisiológica.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos de diferenciación y ensayos.
- Puede requerir adaptación para diferentes líneas de células madre embrionarias o modelos específicos de especies.
- Depende de la calidad constante de los reactivos y del momento preciso de los pasos de diferenciación.
